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生物工程学报
生物工程学报

杨胜利

月刊

1000-3061

cjb@im.ac.cn

010-64807509

100101

北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所B401

生物工程学报/Journal Chinese Journal of BiotechnologyCSCD北大核心CSTPCD
查看更多>>《生物工程学报》是国内外公开发行的全国性学术期刊, 由中国科学院微生物研究所和中国微生物学会共同主办。主要报道生物工程研究的新发展、新成果、新技术。刊登的内容包括：基因工程、细胞工程、酶工程、生化工程、组织工程、生物信息、生物制药、生物芯片等。栏目设有：综述、研究报告、研究简报、技术与方法等。《生物工程学报》创刊于1985年。20多年来，本刊始终以推动生命技术发展和促进国家经济建设为宗旨，及时报道我国生物工程方面的重要研究成果, 有力地促进了国内在这一领域的学术交流，为科研教学和经济建设发挥了积极的作用。本刊已被美国<CA>,<BA>，<MEDLINE>,及<俄罗斯文摘>、中国生物学文摘、中国科学引文数据库、万方数据库、中国科技期刊光盘版等检索系统收录，是中国自然科学核心期刊。
正式出版
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    fliL基因显著影响艰难拟梭菌运动功能及产孢能力

    鲍江舰杨君仪邵瑞瑞张婷...
    1578-1595页
    查看更多>>摘要：鞭毛基底体相关 FliL 家族蛋白(flagellar basal body-associated FliL family protein,fliL)基因编码FliL蛋白,FliL是一种与鞭毛基体相结合的单跨膜蛋白.为研究艰难拟梭菌fliL基因功能,使用非等长同源臂偶联等位交换(allele-coupled exchange,ACE)方法成功构建了fliL基因缺失(△fliL)和回补(∷fliL)突变株,研究突变菌株与野生型菌株(CD630)生长曲线、抗生素敏感性、pH耐受性、运动能力及产孢能力等表型的差异.结果显示,菌株△fliL生长速率及最大生物量均小于菌株CD630,∷fliL回补菌株生长情况回复至野生型.与CD630菌株相比,△fliL对阿莫西林、氨苄青霉素、诺氟沙星的敏感性提高,对卡那霉素、四环素敏感性降低,∷fliL 抗生素敏感性部分回复至野生型水平.与CD630菌株相比,△fliL游泳运动能力显著降低,∷fliL运动能力超越野生型菌株CD630.相比菌株CD630,菌株△fliL在pH值为5时耐受能力显著提高,在pH值为9时,耐受能力显著降低.除此之外,△fliL产孢能力较CD630显著降低,∷fliL产孢能力部分恢复.以上结果表明,艰难拟梭菌fliL 基因与其运动能力、抗生素敏感性、环境耐受能力和产孢能力密切相关,可能进一步影响艰难拟梭菌菌株的致病力.

    艰难拟梭菌非等长同源臂偶联等位交换鞭毛fliL突变株表型

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    具核梭杆菌CarRS双组分系统组氨酸激酶CarS的表达、纯化及生化活性测定

    李竺婷师舷范若辰王路路...
    1596-1608页
    查看更多>>摘要：具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)是一种条件致病菌,能够在结直肠癌组织中富集,影响结直肠癌发生发展的多个阶段.双组分系统在病原菌耐药性、致病性相关基因的调控和表达中起重要作用.本文以具核梭杆菌CarRS双组分系统为研究对象,重点对其组氨酸激酶蛋白CarS进行重组表达和性质研究.利用在线软件SMART、CCTOP和AlphaFold2对CarS二级结构和三级结构进行预测,其结果表明CarS蛋白具有2个跨膜螺旋区,包含9个α螺旋和12个β折叠结构;由两个结构域构成,一是位于N末端的跨膜域(氨基酸1-170),另一个是位于C末端的胞内域,胞内域由信号接收域(histidine kinases,adenylyl cyclases,methyl-accepting proteins,prokaryotic signaling proteins,HAMP)、磷酸受体结构域(histidine kinase domain,HisKA)和组氨酸激酶催化结构域(histidine kinase-like ATPase catalytic domain,HATPase_c)组成.由于全长的 CarS 蛋白未能在宿主细胞中表达,因此根据其二级、三级结构特点,构建了 CarS胞内蛋白的融合表达载体pET-28a(+)-MBP-TEV-CarScyto,并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中进行过表达.经亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析,最终获得纯度较高的CarScyto-MBP蛋白,终浓度达20mg/mL.活性实验结果表明,CarScyto-MBP具有蛋白激酶和磷酸转移酶双活性,麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)标签对CarScyto蛋白的生物活性无影响.上述结果为深入解析CarRS双组分系统在具核梭杆菌中的生物学功能提供了一定的理论基础.

    具核梭杆菌CarRS双组分系统蛋白激酶活性磷酸转移酶活性

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    核纤层蛋白B1通过影响端粒酶活性调控肝癌细胞生长

    王瑞官陈思孙志佳王诗昆...
    1609-1620页
    查看更多>>摘要：核纤层蛋白B1(nuclear lamina protein B1,LMNB1)高表达于肝癌组织中,通过敲低LMNB1探讨其对肝癌细胞增殖的影响及其机制.利用siRNA在肝癌细胞中敲低LMNB1,Western blotting检测敲低效果,使用端粒重复序列扩增法(telomeric repeat amplification protocol assay,TRAP)检测其端粒酶活性变化.利用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测其端粒长度变化.并通过CCK-8、克隆形成、Transwell、划痕实验检测其生长,侵袭和迁移能力变化.利用慢病毒系统构建稳定敲低LMNB1的HepG2细胞,检测其端粒长度及端粒酶活性变化,采用SA-β-gal衰老染色检测细胞衰老情况,通过裸鼠皮下成瘤实验及对肿瘤后续的组化染色,SA-β-gal衰老染色,端粒荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测其对成瘤性的影响.最后利用生物信息分析的方法寻找LMNB1在临床肝癌组织中的表达情况,及其与临床分期、病人生存期的关系.HepG2和Hep3B中敲低LMNB1后端粒酶活性显著降低,细胞增殖、迁移和侵袭能力显著降低,细胞和裸鼠成瘤实验证明稳定敲低LMNB1后端粒酶活性降低的同时端粒长度缩短,细胞发生衰老,此外细胞成瘤性降低,Ki-67表达降低,生物信息分析结果显示,LMNB1高表达于肝癌组织,且与肿瘤分期和患者生存相关.LMNB1在肝癌细胞中过表达,其有望成为评估肝癌患者临床预后的指标和精准治疗的靶点.

    核纤层蛋白B1肝癌端粒酶端粒细胞衰老

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    β-桧木醇联合替加环素对tet(X4)阳性大肠杆菌的体外协同抗菌作用

    张慕琛宋黄威邹之宇杨思源...
    1621-1632页
    查看更多>>摘要：质粒介导tet(X4)基因的出现和流行,严重影响替加环素(tigecycline)对临床多重耐药细菌感染的治疗效果,急需寻找有效的佐剂遏制替加环素耐药性.本研究采用微量棋盘稀释法、时间-杀菌曲线测定β-桧木醇(β-thujaplicin)和替加环素的体外联合抗菌表征,通过测定细菌细胞膜通透性、细菌胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量、铁含量以及替加环素含量等指标,来探究β-桧木醇和替加环素联合使用对tet(X4)基因阳性大肠杆菌(Escherichia coli)的抗菌作用机制.结果表明,β-桧木醇联合替加环素对tet(X4)基因阳性大肠杆菌具有体外协同抗菌效果,且β-桧木醇在抗菌作用浓度范围内无显著溶血性和细胞毒性.机制研究发现,β-桧木醇能显著增大细菌细胞膜的通透性,降低细菌胞内铁含量,干扰铁稳态,诱导细胞内ROS显著增加,从而发挥抗菌效果.进一步研究发现,β-桧木醇可通过干扰细菌铁代谢和增大细菌细胞膜通透性,协同增强替加环素的抗菌效果.本研究结果为β-桧木醇联合替加环素治疗tet(X4)基因阳性大肠杆菌感染提供了理论和实践基础.

    β-桧木醇替加环素tet(X4)协同抗菌铁稳态

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    用于核磁共振研究的淀粉样前体蛋白跨膜区域的表达、纯化和胶束重构

    孙晓宇赵雪琛陈文
    1633-1643页
    查看更多>>摘要：淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)被多次酶切后生成β-淀粉样蛋白(amyloid-β peptide,Aβ),其聚合物的毒性作用会引发阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD).其中,APP 蛋白的跨膜区域(transmembrane domain of amyloid precursor protein,APPTM)与 γ-分泌酶的非特异性切割作用是生成Aβ的关键步骤,在生理条件下重构APPTM对于探究其与γ-分泌酶的相互作用以及AD药物研发具有重要作用.然而,现有的重组APPTM制备方法存在制备效率和产量低等缺点,限制了 APPTM的稳定大规模制备.本研究以大肠杆菌(Escherichia coli)为宿主,使用pMM-LR6载体对APPTM进行融合表达.包涵体蛋白经盐酸胍提取后,依次使用Ni-NTA亲和层析、溴化氰切割融合标签和反相高效液相色谱(reverse phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC),得到了高纯度和高产量的同位素标记的APPTM.进一步将APPTM重构到十二烷基磷酰胆碱(dodecylphosphocholine,DPC)胶束环境中,采集得到了均一、高质量的15N-1H异核单量子关系(heteronuclear singular quantum correlation,HSQC)二维谱.本研究成功建立了 一种高效且可靠的用于表达、纯化和体外重构APPTM的方法,为后续在更天然的模拟膜环境,如脂碟(bicelle)和纳米碟(nanodisc)中探究APPTM及其复合物的结构和功能奠定了良好的基础.

    阿尔茨海默病淀粉样前体蛋白跨膜区域膜蛋白液相核磁共振技术表面活性剂胶束

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    利用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠Mlk3基因探讨其对血压的影响

    高诗娟方光明张燕红杜杰...
    1644-1654页
    查看更多>>摘要：为探讨混合谱系激酶3(mixed lineage kinase 3,Mlk3)基因敲除(knockout,KO)对小鼠血压的影响,采用CRISPR/Cas9系统构建Mlk3基因敲除(Mlk3 knockout,Mlk3KO)小鼠模型.T7核酸内切酶Ⅰ(T7 endonuclease Ⅰ,T7E1)酶切法验证向导RNA(small guide RNA,sgRNA)的活性.体外转录CRISPR/Cas9 mRNA及sgRNA,显微注射至受精卵并移植入假孕母鼠.聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)及 DNA 测序检测基因型.实时荧光定量 PCR(Real-time PCR,RT-PCR)检测Mlk3 mRNA表达,Western blotting及免疫荧光检测Mlk3蛋白表达.尾套法监测小鼠血压.免疫组化及Western blotting检测小鼠主动脉肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)磷酸化水平.PCR基因型鉴定及DNA测序显示Mlk3敲除成功,且Mlk3敲除小鼠未检测到Mlk3蛋白表达,证实CRISPR/Cas9系统成功构建了Mlk3敲除小鼠.Mlk3敲除小鼠在基础状态下血压显著高于同笼对照,且Mlk3敲除小鼠主动脉平滑肌层MLC的磷酸化高于对照组,说明Mlk3具有抗高血压的内源性保护作用.本研究为探讨蛋白激酶Mlk3抗高血压及抗高血压诱导心血管不良重塑的作用机制提供了理想的动物模型.

    基因敲除小鼠CRISPR/Cas9混合谱系激酶3血压肌球蛋白轻链

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    家蚕几丁质去乙酰化酶BmCDA2的基因表达和免疫定位

    何允陈怡菲王清浪张自钰...
    1655-1669页
    查看更多>>摘要：几丁质的去乙酰化修饰与昆虫的发育变态密切相关,几丁质去乙酰化酶(chitin deacetylase,CDA)是这个过程中的关键酶.家蚕(Bombyx mori)是鳞翅目昆虫的代表性昆虫,目前对家蚕CDAs的研究较少.为了更好地揭示BmCDAs对家蚕变态发育的作用,本研究采用生物信息学分析、蛋白表达纯化以及免疫荧光定位等方法对表皮中高量表达的BmCDA2进行了研究.结果发现,BmCDA2有两种mRNA拼接形式BmCDA2a和BmCDA2b,分别在幼虫眠期和化蛹期表皮高量表达,两个基因均有几丁质去乙酰化酶催化结构域(catalytic domain)、几丁质结合结构域(chitin binding domain)和低密度脂蛋白受体结构域(low density lipoprotein receptor domain);Western blotting 结果显示,该蛋白在表皮存在,荧光免疫定位发现BmCDA2蛋白随着幼虫新表皮的生成而逐渐增多,推测BmCDA2可能参与了幼虫新表皮的形成.该结果丰富了家蚕CDAs的生物学功能信息,也为其他昆虫CDA的研究提供一些有价值的参考.

    家蚕几丁质去乙酰化酶2原核表达免疫荧光定位

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    过表达鸡Klf2促进klf7转录抑制脂肪细胞分化

    高琴张皓王英军慕晓玲...
    1670-1683页
    查看更多>>摘要：过表达Krüppel样因子2(Krüppel like factor 2,Klf2)或Klf7可抑制脂肪细胞形成,但是在脂肪组织中Klf2是否调控klf7表达还不清楚.本研究采用油红O染色和蛋白质印迹法技术研究了过表达Klf2对鸡前脂肪细胞分化的影响,结果显示过表达Klf2抑制油酸诱导的前脂肪细胞分化和ppary表达,同时促进klf7表达(P＜0.05).利用Spearman相关性分析研究人和鸡脂肪组织中klf2和klf7的表达数据之间的关系,发现klf2和klf7的表达数据存在明显的正相关(r＞0.1).荧光素酶报告基因分析显示,在鸡前脂肪细胞中过表达Klf2促进鸡klf7启动子(-241/-91、-521/-91、-1 845/-91、-2 286/-91和-1 215/-91)的活性(P＜0.05);此外,在鸡前脂肪细胞中,klf7启动子(-241/-91)报告基因活性与共转染的klf2过表达质粒的浓度正相关(Tau=0.917 66,P=1.074x10-7),过表达Klf2显著促进klf7的mRNA表达水平.综上所述,促进klf7表达可能是Klf2抑制鸡脂肪细胞形成的作用途径之一,鸡klf7翻译起始位点上游-241 bp/-91 bp序列可能介导转录因子Klf2对klf7表达的转录调控作用.

    脂肪细胞分化转录调控启动子活性Krüppel样因子2/7

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    山羊转录因子c-fos克隆、鉴定及功能分析

    胡婷婷王永陈定双龚成思...
    1684-1695页
    查看更多>>摘要：转录因子c-fos在细胞增殖、分化和肿瘤形成中发挥着重要作用.本研究旨在获得山羊c-fos基因序列并阐明其生物学性质,进一步利用过表达手段揭示c-fos在山羊皮下脂肪细胞分化过程中的调控作用.本试验以简州大耳羊为研究对象,用逆转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术克隆获得c-fos基因序列并分析其生物学性质;用实时荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)技术检测cfos基因在山羊心、肝、脾、肺、肾、皮下脂肪和背最长肌7个组织以及皮下脂肪细胞诱导分化的0-120h的表达情况;用基因重组方法构建山羊pEGFP-c-fos过表达载体并转染至皮下前体脂肪细胞诱导分化后,用油红O和Bodipy染色从形态学上观察其对脂滴积聚的影响,用qPCR技术在mRNA水平上检测过表达c-fos对成脂分化标志基因的影响.结果表明,克隆的山羊cfos基因长1 477 bp[编码区(coding sequence,CDS)1 143 bp],编码380个氨基酸,亚细胞定位预测该基因主要分布于细胞核中;表达蛋白具有一个碱性亮氨酸拉链结构;c-fos基因在山羊皮下脂肪组织相对表达水平较高(P＜0.05),在皮下前体脂肪细胞诱导分化后48 h的相对表达水平最高(P＜0.01);过表达cfos可抑制山羊皮下脂肪细胞的脂滴形成,并极显著降低成脂标志基因AP2和C/EBPβ的相对表达水平(P＜0.01),且启动子结合位点预测存在多个结合位点.综上所述,cfos是山羊皮下脂肪细胞分化的负调控因子,通过调控4P2和C/EBPβ 基因的表达来发挥作用.

    转录因子c-fos山羊皮下脂肪细胞分化

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    山羊ZFP36L1基因克隆及表达特性分析

    马箫彤王瑞龙王菲陈定双...
    1696-1709页
    查看更多>>摘要：本研究旨在克隆获取锌指蛋白家族36(zinc finger protein 36-like 1,ZFP36L1)基因,并明确其表达特性,阐明其在山羊不同组织中的表达模式.采集简州大耳羊的心、肝、脾、肺、肾等15 种组织样品,应用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增获得山羊ZFP36L1基因,通过在线工具对基因及蛋白质序列进行生物学分析;再应用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测 ZFP36L1 基因在山羊各个组织及不同分化阶段的肌内前体脂肪细胞中的表达水平,并分析其组织表达谱以及细胞时序表达谱.结果表明,克隆获得山羊ZFR36L1基因序列长度为1 224 bp,编码序列(coding sequence,CDS)区为1017 bp,编码338个氨基酸,是主要定位于细胞核、细胞质的非分泌不稳定蛋白;组织表达谱显示,ZFP36L1基因在各组织中均有表达,在内脏组织、小肠表达量最高(P＜0.01).在肌肉组织以背最长肌表达量最高(P＜0.01).在脂肪组织中,皮下脂肪组织的表达量显著高于其他组织(P＜0.01).诱导分化结果显示,该基因在肌内前体脂肪细胞成脂分化过程中表达呈上调趋势(P＜0.01).以上研究为阐明山羊ZFP36L1 基因的生物学功能提供数据支持.

    山羊ZFP36L1基因克隆肌内前体脂肪细胞诱导分化

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