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生物工程学报
生物工程学报

杨胜利

月刊

1000-3061

cjb@im.ac.cn

010-64807509

100101

北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所B401

生物工程学报/Journal Chinese Journal of BiotechnologyCSCD北大核心CSTPCD
查看更多>>《生物工程学报》是国内外公开发行的全国性学术期刊, 由中国科学院微生物研究所和中国微生物学会共同主办。主要报道生物工程研究的新发展、新成果、新技术。刊登的内容包括：基因工程、细胞工程、酶工程、生化工程、组织工程、生物信息、生物制药、生物芯片等。栏目设有：综述、研究报告、研究简报、技术与方法等。《生物工程学报》创刊于1985年。20多年来，本刊始终以推动生命技术发展和促进国家经济建设为宗旨，及时报道我国生物工程方面的重要研究成果, 有力地促进了国内在这一领域的学术交流，为科研教学和经济建设发挥了积极的作用。本刊已被美国<CA>,<BA>，<MEDLINE>,及<俄罗斯文摘>、中国生物学文摘、中国科学引文数据库、万方数据库、中国科技期刊光盘版等检索系统收录，是中国自然科学核心期刊。
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    荧光素酶mRNA的构建及电穿孔介导的mRNA体内表达特性

    樊玲江周克茹刘艳光王桂芹...
    3379-3389页
    查看更多>>摘要：为构建一种非复制型mRNA平台并探究电穿孔介导的mRNA对小鼠健康状况的影响及蛋白的表达情况,以荧光素酶作为靶标基因,用T7 RNA聚合酶体外转录及酶法加帽加尾的策略制备mRNA,用活体基因导入仪通过电穿孔的方式体内递送mRNA,借助小动物活体成像系统观测荧光素酶蛋白在小鼠体内的表达强度和持续时间.结果表明,使用该非复制型mRNA平台得到的mRNA成功在体内外表达,电穿孔介导的mRNA对小鼠健康体征无明显影响,所有的小鼠均成功表达了荧光素酶蛋白,蛋白表达在电穿孔后第1天达到峰值,在第4天迅速下降,但蛋白表达强度和持续时间存在较大的小鼠个体间差异.研究对非复制型mRNA的构建及其应用于疫苗或肿瘤药物研发具有重要参考价值.

    电穿孔mRNA活体成像荧光素酶

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    B型流感病毒B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018 毒株的遗传进化及其对小鼠的致病性分析

    孟庆鑫焦鹏涛孙蕾王大燕...
    3390-3405页
    查看更多>>摘要：B型流感病毒(influenza B virus,IBV)比A型流感病毒(influenza A virus,IAV)更易引发并发症,在一定季节内造成的疾病负担甚至超过IAV,但目前人们对IBV的关注较少.为了分析IBV临床毒株B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018的遗传进化特点,本研究构建了系统进化树,并以世界卫生组织推荐的疫苗株为参考,对其血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)进行了氨基酸序列同源性及突变位点分析.分析结果发现B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018毒株无谱系间重配现象,与同年疫苗株B/Colorado/06/2017匹配性较差.另外,测定了B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018毒株感染小鼠的半数致死量(median lethal dose,LD50)及其对小鼠的致病性.结果表明,B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018 毒株感染小鼠的 LD50为 105.9TCID50(median tissue culture infective dose),小鼠肺脏中病毒滴度在感染后1 d达到高峰,炎性细胞因子的mRNA水平在感染后12h达到高峰,且感染后肺脏中的肺泡损伤严重,有大量炎性细胞浸润.本研究证明了IBV临床毒株B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018可以感染小鼠并诱发典型的肺脏炎症,为研究IBV致病及传播机制奠定了基础,为评价新型流感疫苗、抗病毒和抗炎症药物提供了理想的动物模型.

    B型流感病毒Victoria谱系遗传进化分析致病性动物模型

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    应用慢病毒shRNA文库结合二代测序筛选白血病细胞系增殖相关IncRNA

    马秋怡石得阳汪碧忱曹牧天...
    3406-3418页
    查看更多>>摘要：长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是包括细胞增殖在内的许多细胞过程的重要调节因子.虽然已有研究表明多种lncRNA在造血系统恶性肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用,但是缺少一个更全面和无偏倚的方法同时研究多个lncRNA中对白血病细胞系产生功能性影响的lncRNA.在此,我们利用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)文库结合高通量测序的方法,筛选对白血病细胞系增殖有影响的lncRNA,确定了74个候选lncRNAs.从中选取lncRNA C20orf204-203作为验证研究对象,发现C20orf204-203在K562和THP-1细胞系中均定位于胞质,敲降C20orf204-203的K562和THP-1细胞系增殖能力降低,早期凋亡细胞增加,BAD基因在mRNA水平上表达量增加,TP53、BCL2蛋白表达量下降,在THP-1细胞系中Caspase 3蛋白表达量减少,激活型Caspase 3蛋白表达量上升,但是二者变化在两种细胞系中不一致.结果表明,在白血病细胞系中敲降lncRNA C20orf204-203会使细胞增殖能力降低.但其在不同细胞系作用途径和机制可能存在差异.这一研究表明了利用shRNA文库结合高通量测序大规模研究lncRNA在白血病细胞系中发挥作用的可行性.

    长链非编码RNAC20orf204-203短发夹RNA文库高通量测序白血病细胞系

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    重组rHSA-hFGF21融合蛋白在毕赤酵母中的表达纯化及活性分析

    黄甜甜齐剑英杨刚刚叶贤龙...
    3419-3432页
    查看更多>>摘要：人成纤维细胞生长因子21(human fibroblast growth factor 21,hFGF21)已成为改善血糖和脂质代谢的候选药物,但却存在半衰期短和易被体内代谢等缺点,导致靶组织利用率低,限制了其临床应用.本研究通过柔性连接肽(GGGGS)3将hFGF21的N端连接至人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的C端,经过毕赤酵母密码子优化后,将重组基因片段rHSA-hFGF21连入pPIC9k和pPICZαA两种载体,并转化到X33、GS115和SMD1168三种不同酵母菌株中.通过加压筛选得到高表达的X33-pPIC9K-rHSA-hFGF21工程菌株,并优化摇瓶诱导条件如OD值、甲醇浓度和诱导时间进一步提高rHSA-hFGF21的表达效率.培养上清经中空纤维膜切向流技术粗分离、Blue亲和层析和Q离子交换层析纯化获得纯度约98.18％的rHSA-hFGF21蛋白.与hFGF21相比,rHSA-hFGF21具有更好的热稳定性和抗胰蛋白酶降解的能力,其血浆半衰期也延长了约27.6倍;中高浓度条件下rHSA-hFGF21刺激HepG2细胞摄取葡萄糖的能力优于hFGF21;在2型糖尿病动物中rHSA-hFGF21比hFGF21具有更好的长效降糖效果.本研究将为FGF21蛋白的大规模生产奠定基础.

    成纤维细胞生长因子21(FGF21)人血白蛋白(HSA)融合蛋白毕赤酵母糖尿病

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    透明质酸微针经皮递送胰岛素智能给药系统用于糖尿病治疗

    肖永成王小斌谢德明
    3433-3442页
    查看更多>>摘要：本研究通过共沉淀法制备了胰岛素(insulin,INS)/Ca3P04复合物和葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOx)/Cu3(PO4)2 复合物,得到的矿化胰岛素(mineralized insulin,m-INS)呈现不规则结晶团簇状,矿化葡萄糖氧化酶(m-Gox)呈花球状形貌,直径约1-2pm.体外模拟释放实验表明,m-INS会随介质pH值降低而释放出INS,pH为4.5时其释放量达到96.68％;酶活力检测实验表明m-GOx的酶活力稳定性高于游离的GOx,在室温放置10 d后仍保持较高活力,而GOx活力小于60％.通过配制葡萄糖溶液模拟正常血糖(5.6 mmol/L)和高血糖(22.2 mmol/L)状态,在葡萄糖溶液中加入m-INS和m-GOx,INS的释放量呈现显著的葡萄糖浓度依赖性,即葡萄糖浓度越高,INS释放量和释放速率越大.最后,将m-INS、m-GOx与透明质酸(hyaluronic acid,HA)溶液混合,制备负载m-INS和m-GOx的HA微针阵列,构建1型糖尿病模型鼠,通过微针给药的方式评估载药HA微针对糖尿病大鼠的血糖控制效果.结果表明:负载m-INS/m-GOx的HA微针能有效递送药物,糖尿病大鼠的平均血糖浓度在l h内下降到约7 mmol/L,并能维持10h的正常血糖,使血糖浓度低于给药前水平长达36 h.与仅负载INS的HA微针相比,m-INS微针具有更好的葡萄糖耐受性、更持久的控糖效果和更小的低血糖风险.相对于其他的缓释系统,本研究中的核心成分制备流程简单、效率高和安全有效,具备较大的商业化潜力.

    透明质酸微针透皮给药糖尿病治疗胰岛素智能释放

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    雷公藤红素抑制Cd2+诱导的神经毒性

    何飞刘园刘素素王娜...
    3443-3452页
    查看更多>>摘要：镉(cadmium,Cd)是环境中常见的一种重金属,Cd2+可以通过穿透血脑屏障,产生神经毒性,从而诱发各种神经退行性疾病,雷公藤红素是雷公藤的一种有效成分,具有抗癌、抗炎等一系列药理作用,本文探究雷公藤红素对Cd2+诱导的相应神经毒性的影响作用.通过细胞增殖实验、细胞膜完整性实验、细胞形态实验探索了Cd2+对小胶质细胞HMC3活力的影响;通过一氧化氮(NO)检测实验、脂质过氧化(malondialdehyde,MDA)检测实验、蛋白免疫印迹实验分析了Cd2+的神经毒性以及雷公藤红素对Cd2+诱导的相应神经毒性的影响.结果表明:与对照组相比,当Cd2+浓度达到40μmol/L时,对HMC3细胞增殖抑制率为(57.17±8.23)％(P＜0.01,n=5),继续增大Cd2+浓度,细胞活性将进一步降低;当Cd2+浓度达到40 μmol/L以上时,HMC3的细胞膜明显受到破坏,并且破坏作用与浓度呈剂量依赖性关系;随着Cd2+浓度的增加,细胞形态开始变化,贴壁效果变差.Cd2+使HMC3细胞释放的NO量显著增加,而雷公藤红素能够有效地抑制Cd2+诱导的HMC3细胞NO的释放;Cd2+使HMC3细胞脂质过氧化水平显著增加,加入10-7 mol/L雷公藤红素后,MDA的释放量显著减少;Cd2+会使p-PI3K蛋白含量增加,而加入了雷公藤红素(10-7、10-6 mol/L)后,p-PI3K蛋白和p-AKT蛋白的激活均被抑制,从而抑制了细胞凋亡.综上所述,雷公藤红素能够抑制Cd2+诱导的小胶质细胞毒性,从而起到神经保护作用.

    雷公藤红素Cd2+小胶质细胞神经保护神经毒性

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    APRT缺陷型CHO细胞系的建立及其重组蛋白表达能力评价

    冯莹莹肖梦珂路江涛王小引...
    3453-3465页
    查看更多>>摘要：中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞是生产复杂重组药物蛋白的首选宿主细胞,腺嘌呤磷酸核糖转移酶(adenine phosphoribosyltransferase,APRT)催化腺嘌呤与磷酸核糖缩合形成腺苷一磷酸,是嘌吟生物合成步骤中的关键酶.采用基因编辑技术敲除CHO细胞中aprt基因,验证获得的APRT缺陷型CHO细胞系的生物学特性;构建两种真核表达载体:对照载体(含有目的基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和弱化载体(含有启动子和起始密码子突变的 aprt弱化表达盒及EGFP),分别转染APRT缺陷型和野生型CHO细胞并筛选获得稳定转染的细胞池;重组CHO细胞传代培养60代并用流式细胞术检测EGFP表达的平均荧光强度,并比较不同实验组重组蛋白EGFP的表达稳定性.PCR扩增和测序结果表明,CHO细胞aprt基因成功敲除;获得的APRT缺陷型CHO细胞系在细胞形态、生长增殖、倍增时间等生物学特性方面与野生CHO细胞无显著差异.目的蛋白瞬时表达结果表明,与野生型CHO细胞相比,转染对照载体和弱化载体的APRT缺陷型CHO细胞系中EGFP的表达分别提高了42％±6％和56％±9％;特别是长期传代培养时,转染弱化载体的APRT缺陷型细胞中EGFP表达量显著高于野生型CHO细胞(P＜0.05);构建的基于APRT缺陷型CHO细胞系能够明显提高重组蛋白的长期表达稳定性.研究结果为建立高效稳定的CHO细胞表达系统提供了一种有效的细胞工程策略.

    中国仓鼠卵巢细胞腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因敲除重组蛋白表达

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    大肠杆菌高密度发酵表达4-羟基苯乙酸酯3-羟化酶及咖啡酸的高效生物合成

    张红林金连胡定行刘贵友...
    3466-3477页
    查看更多>>摘要：来源于大肠杆菌的4-羟基苯乙酸酯3-羟化酶(4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase,4HPA3H)可以催化对香豆酸生物合成咖啡酸.为了实现4HPA3H的扩大生产和咖啡酸的高效生物合成,首先构建过表达4HPA3H的大肠杆菌工程菌,其次使用5L发酵罐进行高密度发酵生产4HPA3H,再而优化采用工程菌株进行全细胞催化产咖啡酸的条件.最终实现了在5 L发酵罐中发酵,工程菌株生物量达到干重34.80 g/L.通过使用5 L发酵罐作为生物反应器进行全细胞催化,经过6h的催化可产生18.74 g/L(0.85 g/(L·OD600))咖啡酸,摩尔转化率为78.81％,是目前文献报道4HPA3H以对香豆酸为底物合成咖啡酸的最高水平.初步实现了高密度培养大肠杆菌表达4HPA3H并高效生物合成咖啡酸,为工业化生产奠定了基础.

    4-羟基苯乙酸酯3-羟化酶咖啡酸高密度发酵全细胞催化

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    基于壳聚糖的可控缓释型微针制备与性能评价

    朱龙庄俭赵泽伟刘俸溢...
    3478-3488页
    查看更多>>摘要：在临床应用上,一种能够持续递送药物的微针(microneedle,MN)系统对于一些疫苗、激素类药物的递送具有重要价值.本文研究设计了一种基于壳聚糖的可控缓释型微针阵列(PVA/CS-MN),将微针贴片与药物相结合用于药物的可控长效缓释.重点研究了PVA/CS-MN的制备优化工艺,并对MN阵列外观形貌、力学性能、溶解与溶胀性能以及体外刺入性能进行了表征.实验结果表明,使用最优工艺制备的PVA/CS-MN具有良好的形貌以及力学性能,可以顺利在皮肤上打开微通道,并实现可控的溶解与溶胀功能.同时,体外透皮扩散实验表明,以抗坏血酸(L-ascorbic acid)为模型药物制备的Vc-PVA/CS-MN在l h内即释放了约57％的药物,随后12 h内缓慢释放了约66.7％的药物,7 d后最终释放了92％的药物.PVA/CS-MN具备可控的缓释特性以及优良的药物递送效率,为药物的持续透皮递送提供了一个新选择.

    壳聚糖缓释型微针刺入性能溶胀性能释药效果

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    敲除eIF4B基因对小鼠胚胎肝脏细胞凋亡的影响

    王国庆陈彪陈玉海朱倩文...
    3489-3500页
    查看更多>>摘要：真核翻译起始因子 4B(eukaryotic translation initiation factor 4B,eIF4B)在mRNA 翻译起始、细胞存活和增殖过程中发挥着关键作用,然而其在生物体内的生物学功能仍存在许多疑问.本研究利用elF4B基因敲除小鼠模型,结合苏木精和伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色、流式细胞术、Western blotting和免疫组化等一系列实验技术手段,探究了eIF4B在胚胎发育过程中的功能及作用机理.结果显示,eIF4B 敲除小鼠胚胎的肝脏呈现严重病理损伤,主要表现为胚肝细胞的凋亡和坏死,而小鼠胚胎的肺脏、脑、胃和胰腺则发育正常.进一步研究发现,在eIF4B敲除小鼠的胚胎肝脏中活化型caspase 3(cleaved-caspase 3)的表达水平显著升高.此外,eIF4B敲除小鼠的胚胎成纤维细胞和胚胎肝脏中mTOR通路下游信号分子p70S6K的表达和磷酸化水平以及4EBP1的磷酸化水平显著升高.综上所述,eIF4B敲除导致cleaved-caspase 3表达增加和mTOR信号通路过度活化,促进胚肝细胞的凋亡,致使小鼠胚肝发育异常,最终引发小鼠胚胎死亡.本研究揭示了eIF4B在胚胎发育过程中的重要作用,为深入了解eIF4B在生物体内的生物学功能提供了新的科学依据.

    真核翻译起始因子4B胚胎肝脏活化型caspase3mTOR

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