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中国兽医科学
中国农业科学院兰州兽医研究所
中国兽医科学

中国农业科学院兰州兽医研究所

殷宏

月刊

1673-4696

zgsykx@zgsykx.com

0931-8342195

730046

甘肃省兰州盐场堡徐家坪1号

中国兽医科学/Journal Chinese Veterinary ScienceCSCD北大核心CSTPCD
查看更多>>《中国兽医科学》是由农业部主管、中国农业科学院兰州兽医研究所主办的兽医专业学术性期刊。继1999年获首届国家期刊奖、2003年获第二届国家期刊奖百种重点期刊奖之后，2005年又荣获第三届国家期刊奖提名奖。为全国百余种畜牧兽医类期刊中唯一获得国家期刊奖的期刊。 《中国兽医科学》办刊宗旨是：报道国内外兽医科学的研究进展和水平，推广兽医科学研究成果，反映国内外兽医科学研究动态，探讨新的兽医学理论和研究方法。主要栏目有：专家论坛、微生物学、寄生虫学、流行病学、药物学、中兽医学、普通病学、基础兽医学、综述专论、研究简报等。适于兽医科学研究人员、农业院校动物医学、动物科学专业师生阅读，也适合各级畜牧兽医技术人员和各级畜牧兽医行政管理人员参考。热忱欢迎广大兽医科研、教学及其他学科科技工作者踊跃投稿。本刊对所有来稿均采取双盲审稿，即将严格筛选的稿件送有关专家评审，作者不知审稿专家，审稿专家不知作者，以公平、公正地择优录用。经评审录用的文稿本刊力争在最短的时间内刊出。投稿者请登陆本刊网站参阅本刊投稿指南，投稿电子信箱：zgsykx@zgsykx.com。
正式出版
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    貉源阿留申病毒感染性克隆的构建及病毒拯救

    彭倩文赵永强邵西群王桂武...
    853-858页
    查看更多>>摘要：旨在建立貉源阿留申病毒(RFAV)反向遗传系统,为在全基因水平上研究阿留申病毒的致病机制以及疫苗的研制提供平台.前期通过分段克隆成功获得RFAV中间编码区序列M1、M2、M3及末端序列信息.通过无缝克隆技术将RFAV中间编码区序列M1、M2、M3及人工合成的末端编码区序列构建到表达载体pBBSma Ⅰ上,测序验证获得了全长质粒pBB-RFAV,将pBB-RFAV转染至F81细胞进行病毒拯救.通过细胞病变观察、PCR检测、qPCR检测病毒相对表达量、间接免疫荧光试验(IFA)、病毒粒子电镜观察共同验证拯救病毒.结果显示,细胞在转染后第48小时即可观察到明显的细胞病变,PCR检测到RFAV片段,qPCR鉴定发现拯救病毒可在F81细胞上稳定传代,增殖动态与水貂阿留申病毒(AMDV)相似,IFA结果显示感染细胞呈现特异荧光信号,通过电镜观察发现拯救病毒的粒子形态与AMDV已知形态特征基本一致.上述结果表明,构建了 RFAV全基因组感染性克隆,并成功拯救出rRFAV,为深入研究阿留申病毒的病原学和免疫学奠定了基础.

    貉源阿留申病毒感染性克隆病毒拯救反向遗传操作系统

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    CpG和poly I∶C增强口蹄疫病毒样颗粒疫苗免疫效果的研究

    任丽华罗新董虎谭书桢...
    859-865页
    查看更多>>摘要：本研究旨在评估CpG和polyI∶C对口蹄疫(FMD)病毒样颗粒(VLPs)疫苗的免疫增强效果.以纯化的O型FMD VLPs抗原为基础,使用VLPs-CpG和VLPs-polyI∶C刺激小鼠骨髓源性树突状细胞(BMDC),通过流式细胞术分析CD40和CD86在BMDC中的表达水平.进一步将VLPs、VLPs-CpG和VLPs-poly I∶C分别与ISA206乳化制备疫苗,并免疫豚鼠,通过检测特异性抗体、中和抗体、脾淋巴细胞增殖以及攻毒试验评估CpG和poly I∶C对VLPs疫苗免疫效果的影响.结果显示,VLPs-CpG组和VLPs-poly I∶C组的CD86表达水平高于VLPs组,ISA206佐剂联合poly I∶C、CpG均能提高攻毒保护率,而且ISA206联合CpG可以加速特异性抗体及中和抗体反应,提高脾淋巴细胞增殖水平.本研究结果表明,CpG和poly I∶C均能增强FMD VLPs疫苗的免疫效果,具有潜在的开发应用价值.

    口蹄疫病毒样颗粒CpGpolyI∶C免疫效果

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    猫疱疹病毒1型病毒样颗粒在酵母中的制备及体外组装

    赵梦杉吕熙王运航裴辰辰...
    866-872页
    查看更多>>摘要：为研发猫疱疹病毒1型(FHV-1)病毒样颗粒(VLPs)疫苗,将FHV-1 gD基因和自组装蛋白1301基因序列融合后克隆到pPink-HC载体中,由毕赤酵母表达重组gD蛋白.随后观察不同pH对蛋白质表达和VLPs组装效果的影响.结果显示,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,发现培养基pH3.0条件下毕赤酵母表达出了完整的重组gD蛋白,而pH6.0条件下表达的蛋白分子质量小于预计大小;另外,组装液pH8.0时VLPs的组装效果优于pH6.0、7.0.结果表明,酸性环境可有效抑制毕赤酵母内蛋白酶对重组gD蛋白的水解作用,重组gD蛋白可在弱碱性环境中利用自组装蛋白1301在体外完成组装,为FHV-1 VLPs疫苗制备奠定了基础.

    猫疱疹病毒1型病毒样颗粒酵母表达系统gD基因

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    猪流行性腹泻病毒S蛋白外分泌信号肽筛选及稳定表达细胞系的构建

    王传红宋旭刘诗雨张格格...
    873-880页
    查看更多>>摘要：为了优化在真核细胞中猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的分泌表达,且构建稳定表达的细胞系,本研究设计合成了 9个信号肽引物,通过同源重组的方式得到表达PEDV变异株AH2012/12株S全长蛋白的9个重组表达质粒,瞬时转染HEK 293T细胞后,通过Western-blot验证蛋白外分泌表达水平,结果显示,筛选出的含跨膜蛋白酶丝氨酸信号肽的S蛋白具有较好的外分泌表达特性;利用G418筛选,获得稳定表达PEDVS蛋白的单克隆细胞,通过传代验证不同代次的蛋白表达水平,成功构建了可稳定外分泌表达PEDV S的CHO细胞系.结果显示,可在100 mL CHO-PEDV/S细胞培养上清中获得约5 mg的PEDV S蛋白,提高了 PEDV S蛋白的表达和分泌,为进一步研制PEDV亚单位疫苗奠定了基础.

    猪流行性腹泻病毒S蛋白信号肽稳定表达亚单位疫苗

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    荧光素酶免疫吸附法高灵敏检测蓝舌病病毒抗体方法的建立

    张鸿歌田占成独军政王琼洁...
    881-887页
    查看更多>>摘要：为了建立一种高效检测动物血清中蓝舌病病毒(BTV)抗体的检测方法,以BTV血清群特异性VP7抗原与荧光素酶蛋白相融合表达的标记蛋白(VP7-NLuc)为检测抗原建立了荧光素酶免疫吸附(VP7-NLuc-LISA)方法,用于检测BTV抗体.结果表明:BTV阳性血清能特异性识别VP7-NLuc融合蛋白;监测BTV-1灭活疫苗免疫绵羊血清中BTV抗体动态结果表明,VP7-NLucLISA方法与商品化竞争性ELISA(c-ELISA)试剂盒的检测结果呈高度相关性(R=0.76,P＜0.001);对264份田间血清样本的调查结果表明,建立的VP7-NLuc LISA方法与商品化c-ELISA试剂盒的符合率为98.86％,其相对特异性为99.52％,相对敏感性为96.49％.结论:所建立的VP7-NLuc-LISA方法可作为大规模动物BTV流行病学调查和监测的新方法.

    蓝舌病病毒VP7蛋白荧光素酶免疫吸附试验c-ELISA血清学检测

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    基于Dhori病毒GP蛋白间接ELISA检测方法的建立

    汪烘宇高赟马晓芹朱忠正...
    888-895页
    查看更多>>摘要：本研究利用原核表达系统表达Dhori病毒(DHOV)糖蛋白(GP),以此为抗原建立间接ELISA检测方法.根据DHOV-GRT169毒株GP基因设计引物并扩增得到去除跨膜区与信号肽的基因片段,构建了重组表达质粒pET-32a-GP,测序验证正确后转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中经IPTG诱导表达.采用镍柱亲和层析法纯化重组GP蛋白.以DHOV阳性山羊血清为一抗,经Western-blot检测纯化蛋白后,以纯化的pET-32a-GP为包被抗原,通过方阵滴定法优化反应条件,建立检测DHOV血清抗体的间接ELISA检测方法,评价其重复性、敏感性和特异性.采用建立的间接ELISA检测方法检测新疆部分地区采集的不同动物血清样本中DHOV抗体.结果显示,pET-32a-GP原核表达质粒构建正确,GP蛋白大小约为66.8 ku,反应原性良好;ELISA条件优化确定的最佳包被浓度为4μg/mL、一抗稀释度为1∶1 000、一抗孵育时间为30 min、二抗稀释度为1∶3 000、二抗孵育时间为30 min、TMB显色时间为4 min;重复性试验结果表明,批内与批间变异系数(CV)均＜10％;敏感性试验表明,当阳性血清稀释度为1∶1 400时具有良好的敏感性;特异性试验表明,建立的间接ELISA检测方法检测GTV、CCHFV和TAMV时呈阴性反应;随机选取343份采于新疆不同地区的动物血清进行ELISA检测,检出48份血清结果呈阳性,阳性检出率为13.99％.该检测方法的建立为DHOV的流行病学分析提供了基础,为进一步研究DHOV GP蛋白的生物学功能、检测试剂盒的开发以及疫苗的研制提供了理论依据.

    Dhori病毒GP蛋白原核表达间接ELISA

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    PCV2a、PCV2b和PCV2d多重PCR检测方法的建立及应用

    谭健梅赵雨欣黄艳玲周小汇...
    896-904页
    查看更多>>摘要：为了建立一种能够快速鉴别PCV2a、PCV2b和PCV2d的方法,本研究针对PCV2a、PCV2b和PCV2d这3个基因型分别设计3组特异性引物,通过构建阳性标准质粒,筛选出最适引物组合,建立了一种PCV2分型的多重PCR检测方法,并对该方法进行优化后,开展特异性、灵敏度、重复性试验以及临床样品检测.结果显示,利用筛选出的最适引物组合建立了多重PCR检测方法,能特异性扩增出3个目的条带:PCV2a(321 bp)、PCV2b(190 bp)和PCV2d(561 bp),探索出最佳退火温度和循环数分别为60 ℃和25个,与其他病原(PPV、PRV、PEDV、TGEV、PRRSV、CSFV)无交叉反应;对构建的阳性标准质粒的最低检测拷贝数为103 copies;同一模板的3次重复性试验结果一致;检测2个猪场流行的PCV2基因型毒株,并通过测序和进化分析进一步验证了该检测方法的准确性.结果表明,本研究建立的多重PCR检测方法有助于开展PCV2a、PCV2b和PCV2d的快速鉴别诊断,为PCV2的防控以及流行病学研究提供了技术支持.

    PCV2aPCV2bPCV2d共感染多重PCR

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    鸡毒支原体和滑液囊支原体双重基础RPA检测方法的建立

    田兴苗王健霖戴莎莎郭磊...
    905-914页
    查看更多>>摘要：鸡毒支原体(MG)和滑液囊支原体(MS)是对家禽危害最大的两种支原体,本研究拟建立基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的MG、MS双重检测方法.以MG的mgc2基因、MS的vlhA基因为检测靶标设计数对引物,通过筛选得到最佳引物,优化反应时间和反应温度以确定最佳反应条件,通过优化MG、MS最佳引物配比确定双重基础RPA的反应体系,并进行灵敏度、特异性、重复性试验,用所建方法对120份临床样品进行检测.结果显示,建立的MG、MS双重基础RPA检测方法在37 ℃下反应20 min即可完成扩增,其最佳引物配比为0.6∶1.4.以重组质粒为模板时,MG、MS的最低检出限分别为3.75 copies/μL、3.46 copies/µL;以基因组DNA为模板时,MG、MS的最低检出限分别为1.23 × 10-3 ng/μL、5.68 × 10-3 ng/μL.该方法具有良好的特异性和稳定性.分别用该方法与OIE推荐的单重PCR方法检测120份临床样品,结果表明,该方法的检出率高于OIE的PCR方法,与OIE的PCR方法一致性较强.上述结果表明,建立的MG、MS双重基础RPA检测方法具有操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好的优点,可实现临床MG、MS感染的鉴别诊断.

    鸡毒支原体滑液囊支原体重组酶聚合酶扩增技术检测方法

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    布鲁氏菌量子点荧光微球免疫层析试纸条的研制

    许玉静杨若松李翀华利忠...
    915-920页
    查看更多>>摘要：为制备基于量子点荧光微球的布鲁氏菌免疫层析试纸条,将布鲁氏菌脂多糖单克隆抗体和山羊抗鼠IgG抗体分别作为检测线和质控线喷涂在硝酸纤维素膜上,以量子点荧光微球标记布鲁氏菌脂多糖单克隆抗体,稀释后喷涂在玻璃纤维素膜上,最后进行组装、切割制成检测用试纸条,并测定其敏感性、特异性和稳定性.以布鲁氏菌荧光定量PC R检测技术为对照,应用该试纸条检测临床样本120份,比较两种方法的符合率.结果显示,建立的量子点荧光微球免疫层析试纸条性能较好,检测敏感性达到1 ng/mL;特异性较好,与其他病原没有交叉反应;常温保存18个月或37 ℃保存28 d,其稳定性较好,变异系数分别为3.2％和14.6％;利用该试纸条和荧光定量PCR方法对120份临床样本进行检测,与荧光定量PCR检测结果相比,其阳性符合率为91％,阴性符合率为100％,总符合率为99％.上述结果表明,该试纸条操作简单、快速稳定、灵敏度高、成本低,20 min内即可完成检测,样本获取容易,可实现现场快速检测,在布鲁氏菌病的病原检测及净化工作中具有良好应用前景.

    布鲁氏菌量子点荧光微球免疫层析技术

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    二氧化锰纳米片介导的旋毛虫病检测方法的建立

    冯馨锐邹敏鸿徐凝赵阳...
    921-929页
    查看更多>>摘要：以半胱氨酸蛋白酶抑制剂样蛋白(Cystatin-like protein,CLP)为研究对象,以实验室前期制备的重组蛋白rCLP为检测抗原进行包被,抗CLP单克隆抗体(McAb)1H9作为竞争抗体,利用二氧化锰纳米片独特的光学特性,建立一种准确、快速、高效的旋毛虫病比色免疫测定方法.采用旋毛虫人工感染猪血清、其他寄生虫感染猪血清及常规病毒疫苗免疫猪血清对该方法的特异性、敏感性进行验证.结果显示,该方法检测刚地弓形虫、微小隐孢子虫、猪囊尾蚴、猪蛔虫、猪鞭虫感染猪的血清和常规病毒疫苗(猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒和口蹄疫病毒疫苗)免疫猪血清均为阴性,无交叉反应.对高(10 000条/头)、中(1 000条/头)、低(100条/头)3组感染剂量感染后不同时间的人工感染猪血清进行检测,该方法在高剂量组中检测的血清抗体阳性转化时间与商品化试剂盒的检测结果一致,在中、低剂量组中血清抗体阳性转化时间晚于商品化试剂盒.同时,该方法在低剂量组中检测的旋毛虫感染阳性检出率高于人工消化法的检测结果,说明该方法敏感性较高.对所建立的方法进行加标回收验证,回收率为98.8％～102.7％,表明该方法稳定性高.以上结果表明,本研究建立的二氧化锰纳米片介导的旋毛虫病检测方法特异性好、敏感性高、操作简单、无须大型仪器即可出结果,可用于旋毛虫病的快速筛检.

    旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂样蛋白比色免疫测定二氧化锰纳米片

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