查看更多>>摘要:[目的]从线粒体损伤角度探究双酚A(BPA)暴露引起小鼠睾丸间质细胞(TM3)凋亡的作用机制.[方法]利用不同浓度BPA(0、10、30、60、90、120、150 μmol/L)处理TM3细胞24 h后,采用CCK-8法筛选出引起细胞凋亡的最低BPA浓度.将TM3细胞随机分为对照组(0 μmol/L BPA)和BPA组(60 μmol/L BPA),每组3个重复,各处理24 h.通过倒置光学显微镜观察细胞状态,TUNEL染色观察细胞凋亡.再将TM3细胞随机分为对照组(0 μmol/L BPA)、BPA 组(60 μmol/L BPA)、BPA 和 N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)共处理组(60 μmol/L BPA+5 mmol/L NAC),每组3个重复,各处理24 h.ELISA法检测细胞培养上清中丙二醛(MDA)含量和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性,试剂盒检测细胞内活性氧(ROS)水平,JC-1染色观察细胞线粒体膜电位,实时定量PCR检测细胞中谷胱甘肽过氧化物酶1(Gpx1)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰剂亚基(Gclm)、过氧化氢酶(Cat)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(Gclc)、线粒体融合蛋白2(Mfn2)、NAD依赖性蛋白脱乙酰酶Sirtuin3(Sirt3)、半胱天冬酶3(Casp3)、细胞色素C(Cycs)、B淋巴细胞瘤-2(BCL-2)相关X蛋白(Bax)基因mRNA表达水平,Western blotting检测BAX和细胞凋亡调节因子BCL-2蛋白的相对表达量,流式细胞仪检测细胞凋亡率.[结果]TM3细胞在60 μmol/L BPA处理24 h后,细胞相对存活率开始出现极显著下降(P<0.01),细胞凋亡率极显著增高(P<0.01),细胞数量明显减少.与对照组相比,60 μmol/L BPA处理24 h后,TM3细胞中MDA含量极显著增加(P<0.01),T-SOD活性极显著下降(P<0.01),抗氧化相关基因(Gpx1、Cat、Gclm、Gclc基因)mRNA表达水平显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01),ROS生成极显著增加(P<0.01);细胞中红/绿荧光强度比值极显著下降(P<0.01),线粒体功能相关基因(Mfn2、Sirt3基因)mRNA表达水平极显著降低(P<0.01),线粒体凋亡通路相关基因(Casp3、Cycs、Bax基因)mRNA表达水平极显著升高(P<0.01),BAX蛋白表达量极显著升高(P<0.01),BCL-2蛋白的相对表达量极显著降低(P<0.01),细胞凋亡率极显著升高(P<0.01).与BPA处理组相比,BPA+NAC处理组TM3细胞中MDA含量显著降低(P<0.05),T-SOD活性显著升高(P<0.05),抗氧化相关基因(Gpx1、Cat、Gclm、Gclc基因)mRNA表达水平显著升高(P<0.05),ROS生成极显著减少(P<0.01),细胞中绿色荧光极显著减弱,红色荧光极显著增强,红/绿荧光强度比值显著升高(P<0.05),线粒体功能相关基因(Mfn2、Sirt3基因)mRNA表达水平显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01),线粒体凋亡通路相关基因(Casp3、Cycs、Bax基因)mRNA表达水平极显著降低(P<0.01),BAX蛋白表达量极显著降低(P<0.01),BCL-2蛋白相对表达量极显著升高(P<0.01),细胞凋亡率极显著下降(P<0.01).[结论]BPA暴露可导致TM3细胞发生氧化应激,引起线粒体功能受损,从而诱导细胞凋亡.