查看更多>>摘要：[目的]非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是对生猪养殖业危害极大的一种病原体,B602L蛋白作为其重要的非结构蛋白,是衣壳蛋白p72折叠为正确的三级结构的伴侣分子之一,在病毒组装成二十面体结构的过程中发挥着关键作用.特异性抗体对于抗非洲猪瘟免疫应答机制及血清学检测方法研究具有重要意义,本研究旨在获取ASFV B602L蛋白,并制备抗ASFV B602L蛋白的多克隆抗体,为ASFV B602L蛋白功能研究及相关诊断试剂的研发提供材料.[方法]以ASFV China/2018/AnhuiXCGQ株的B602L基因为研究对象,应用生物信息学软件对B602L蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构、抗原性和蛋白结构进行分析后,利用同源重组的方法将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经诱导表达获得B602L重组蛋白,利用镍柱亲和层析进行蛋白纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting对B602L蛋白纯化效果进行验证.将纯化后的B602L蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接ELISA方法测定多克隆抗体效价,通过Western blotting和Dot blotting检测多克隆抗体特异性.[结果]生物信息学分析表明,B602L蛋白属于稳定性亲水蛋白,无跨膜区和信号肽.二级结构主要含有α-螺旋(54.91％)、延伸链(9.81％)和无规则卷曲(32.08％).成功构建了ASFV B602L 重组质粒,SDS-PAGE 和 Western blotting 结果显示,重组菌 pET-28a-B602L-BL21 在16 ℃、0.5 mmol/L IPTG诱导下高效表达,获得的重组蛋白主要表达在BL21菌株上清中,大小约为70 ku,且能与ASFV阳性血清特异性结合.间接ELISA检测结果显示,制备的抗B602L鼠源多克隆抗体效价达1∶40 9600,Western blotting和Dot blotting试验结果表明,抗B602L鼠源多克隆抗体能够特异性识别B602L蛋白.[结论]原核表达的B602L重组蛋白具有良好的免疫原性,能够与ASFV阳性血清特异性结合,制备的鼠抗ASFV B602L蛋白多克隆抗体具备较好的生物学活性.本试验结果可为进一步研究ASFV B602L蛋白的生物学功能和非洲猪瘟诊断方法的建立提供生物材料和理论支撑.
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