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中国预防兽医学报
中国预防兽医学报

孔宪刚

月刊

1008-0589

zgyfsyxb@vip.sina.com.cn

0451-85935050 18946066050 18946066181

150001

哈尔滨市南岗区马端街427号

中国预防兽医学报/Journal Chinese Journal of Preventive Veterinary MedicineCSCD北大核心CSTPCD
查看更多>>本刊是由国家科技部批准，农业部主管并委托中国农业科学院哈尔滨兽医研究所主办的国家级学术刊物，双月刊，国际标准大16开本，120页。刊号ISSN1008-0589，CN23-1417/S。本刊是中国自然科学核心期刊、中国期刊网入网期刊。中国科学引文数据库来源期刊，中国学术期刊评价数据库来源期刊。国内外公开发行。本刊始终坚持社会主义办刊方向，坚持“面向、依靠、攀高峰”方针，坚持理论与实践相结合，提高与普及相结合，以提高为主的办刊方针，大力提倡学术性、科学性、实用性、创新性、及时报道国内外预防兽医学方面的新进展、新成果、积极开展学术交流，为促进我国兽医科技事业的发展和畜禽疫病水平的提高，为加速科技成果的转化做出了重大贡献。
正式出版
收录年代

    表达鸡传染性喉气管炎病毒gD蛋白的重组嵌合型新城疫病毒La Sota株的构建

    田静格徐鸣荷王向东张意航...
    659-665页
    查看更多>>摘要：为构建表达鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白D(gD)的重组新城疫病毒(NDV)La Sota株,本研究将ILTV强毒株gD基因胞外域与NDV F基因信号肽、跨膜域和胞质尾区融合,并插入到含有NDV基因VII型F和HN基因的嵌合型La Sota株感染性cDNA克隆pLa Sota-VIIF/HN的P和M基因之间,将获得的重组感染性克隆pLa Sota-VIIF/HN-gD与辅助质粒pCIneo-NP-P-L共转染BHK-21细胞,拯救出表达gD蛋白的重组嵌合型NDV La Sota株rLaSota-VIIF/HN-gD,并采用血凝试验鉴定正确后,将重组病毒在9日龄SPF鸡胚中连续传至10代,提取10代重组病毒基因组RNA,反转录成cDNA作为模板,以ILTV gD基因插入位点两侧的鉴定引物进行PCR鉴定;采用第10代重组病毒感染BHK-21细胞,以ILTV gD蛋白多克隆抗体作为一抗进行间接免疫荧光试验(IFA);分别对鸡红细胞吸附的重组病毒感染的鸡胚尿囊液上清和从红细胞上解离下来的纯化的重组NDV病毒粒子经western blot鉴定,并对重组病毒对鸡胚的致病性和在鸡胚中的复制动态进行初步研究.PCR结果显示ILTV gD基因能够在重组病毒中稳定存在;IFA和western blot鉴定结果显示,重组病毒能够正确表达ILTV的gD蛋白,而且gD蛋白嵌合表达在重组病毒颗粒上.鸡胚致病性试验和鸡胚中的复制动态试验结果显示,重组病毒保持了La Sota疫苗株的低致病性和良好的复制特性,rLaSota-VIIF/HN-gD的鸡胚平均死亡时间(MDT)为168 h,1日龄雏鸡脑内接种该重组病毒的致病指数(ICPI)为0.20,鸡胚半数感染量(EID50)峰值可达10-8.66/100 μL.本研究所制备的重组病毒rLaSota-VIIF/HN-gD为研制基因VII型NDV和ILTV的二联活疫苗奠定了基础.

    传染性喉气管炎病毒重组嵌合型新城疫病毒gD蛋白二联活疫苗

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    多杀性巴氏杆菌的分离鉴定和全基因组测序分析

    王凤杰刘万段文龙李娜...
    666-673页
    查看更多>>摘要：多杀性巴氏杆菌(Pm)可感染多种动物,引起肺炎或全身性败血症,造成严重的经济损失.为鉴定河北昌黎县某肉牛养殖场导致牛大批病死的病原,本研究从病牛肺脏中分离到疑似Pm的菌株,对其进行革兰氏染色观察,16S rDNA基因的PCR扩增与序列分析,并对其荚膜和脂多糖进行PCR分型,PCR扩增其7个管家基因后分析分离菌的多位点序列分型(MLST).结果显示,分离株为革兰氏阴性菌,与Pm的16S rDNA基因序列同源性达99.87%,表明分离到一株Pm.PCR分型鉴定结果显示其为血清B型和脂多糖L2型,MLST分型为ST44型,将该Pm分离株命名为PmB-1.将PmB-1以4.88 cfu/只经腹腔注射感染小鼠,进行致病性试验,结果显示PmB-1能引起小鼠内脏出血病变.采用IlluminaHiseq二代结合PacBio三代测序平台对PmB-1进行全基因组测序及生物信息学分析.结果显示,PmB-1基因组含1条染色质,长 2 331 836 bp,编码2 141个基因,并含19个rRNA,58个tRNA和42个sRNA;含有3个前噬菌体、5个基因组岛,5个获得性免疫(CRISPR-Cas)系统、3个插入序列以及1个转座子元件.致病性预测分析结果显示,PmB-1含244个毒力相关基因,224个耐药基因,495个基因参与病原与宿主的互作,14个基因编码分泌系统蛋白,535个基因编码转运蛋白,190个基因编码分泌蛋白,499个基因编码跨膜蛋白,17个基因编码双组分调控系统.本研究分离到一株Pm,并对其进行小鼠致病性试验,全基因组测序和生物信息学分析,为预防Pm的感染、流行和研究其致病机制提供了参考依据.

    多杀性巴氏杆菌分离鉴定全基因组测序生物信息学分析

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    白头翁汤预防禽大肠杆菌病作用机制的研究

    王旭贞芦洪江郝松华王淑芳...
    674-682页
    查看更多>>摘要：为初步探究白头翁汤(BTWT)对肉鸡大肠杆菌感染的作用靶点,本研究通过HERB2.0数据库筛选BTWT作用靶点,再利用疾病数据库Gene cards得到大肠杆菌感染的相关靶点,筛选出药物与疾病的交集靶点.利用STRING在线分析平台构建BTWT抑制大肠杆菌感染的蛋白相互作用(PPI)网络图并筛选核心靶点,进行蛋白质的GO功能和KEGG信号通路分析,对得到的核心靶点进行分子对接验证.结果显示,筛选到BTWT的有效成分95个,疾病靶点462个,药物与疾病相互作用的交集靶点25个,核心靶点22个.GO分析得到49个功能条目,包括生物过程41个(如巨噬细胞活性、免疫应答和炎症反应)、细胞组分4个(如细胞外空间、胞浆)、分子功能4个(如干扰素-γ受体结合、细胞因子活性).KEGG信号通路分析得到11条信号通路,涉及C型凝集素受体信号通路、Toll样受体信号通路、细胞凋亡、NOD样受体信号通路等.分子对接结果显示,γ-氨基丁酸与超氧化物歧化酶1(SOD1)、秦皮素与白介素-10(IL-10)、槲皮素与IFN-γ(干扰素-γ)对接的自由能均<0.选取60只健康肉鸡,随机分为3组,20只/组,分别为健康对照组(C组)、感染组(M组)和BTWT组(PD组),C组和M组饲喂基础日粮,PD组在肉鸡基础日粮中加入10%BTWT中药液,连续饲喂7d,M组和PD组在第8d口服大肠杆菌O78株(1.09×108 cfu),2 d后计算BTWT对大肠杆菌感染肉鸡的免疫保护率和免疫器官指数,利用ELISA试剂盒测定各组鸡血清中细胞因子、抗氧化指标的含量,光学显微镜下观察各组鸡空肠组织病变.结果显示,与M组相比,BTWT对肉鸡抵抗大肠杆菌感染具有一定的免疫保护率,保护率为20%.PD组鸡法氏囊指数和胸腺指数有所升高,但与M组差异不显著(P>0.05),脾脏指数显著降低(P<0.05);PD组鸡血清中IgA含量显著升高(P<0.05),IL-10、TNF-α和IFN-γ的含量显著降低(P<0.05);PD组鸡血清中SOD和GSH-PX水平显著升高(P<0.05),MDA水平显著降低(P<0.05),空肠的损伤情况得到缓解.以上结果表明,BTWT对肉鸡大肠杆菌感染有较好的预防作用,通过调节感染肉鸡血清中SOD、IL-10及IFN-γ的分泌水平缓解大肠杆菌感染造成肉鸡肠道的损伤,为深入研究BTWT预防大肠杆菌感染的作用机制提供了新思路.

    白头翁汤大肠杆菌肉鸡网络药理学

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    新型鹅源星状病毒广西流行株GoAstV-GXHZ01-2022基因组分子特征分析

    谢守玉熊陈勇黄张玲谢颖...
    683-690页
    查看更多>>摘要：为研究新型鹅源星状病毒(GoAstV)广西流行株基因组的分子特征,本研究采集广西3只疑似GoAstV感染发病雏鹅的3份组织病料样品(每份样品包括肾脏、肝脏和脾脏),采用荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测GoAstV,以GoAstV阳性样品的核酸为模板,经RT-PCR分段扩增、测序及拼接获得GoAstV广西株的全基因组序列,采用BioEdit软件分析上述获得的GoAstV全基因组序列与该病毒参考株各功能基因(ORF1a、ORF1b及ORF2)的相似性,采用Bepipred及NetNGlyc软件预测该病毒Cap蛋白的抗原表位与N-糖基化位点,通过Mega 7.0软件绘制各功能基因的进化树,通过RDP 5软件分析ORF基因序列的重组事件.结果显示,RT-qPCR检出3份GoAstV阳性样品,并经测序获得1条GoAstV广西流行株GoAstV-GXHZ01-2022全基因组序列,该基因组全长为7 149 bp,其中5'非编码区(5'UTR)长143 bp,ORF全长6 929 bp,3'UTR长77 bp;GoAstV-GXHZ01-2022株与经典GoAstV代表株的ORF1a、ORF1b及ORF2基因序列的相似性分别为53.0%～53.4%、63.2%～63.5%及48.2%～48.4%,与新型GoAstV参考株相应基因序列的相似性分别为97.0%～99.6%、98.1%～99.8%及97.5%～99.8%;Cap蛋白抗原表位预测结果为aa6～aa16、aa20～aa66及aa80～aa86等共29个区域存在抗原表位,N-糖基化位点预测结果为81NSTD84、401NTTG404、464NITF467及531NTST534;功能基因的进化树结果显示,GoAstV-GXHZ01-2022株与新型GoAstV参考株均处于同一进化分支,与禽星状病毒3型(AAstV-3)流行株遗传距离较近,与AAstV-1次之,与AAstV-2最远;基因重组分析结果显示,GoAstV-GXHZ01-2022株的ORF1a和ORF2检测到重组信号,主要亲本株为新型GoAstV安徽株AstV/AH01/Goose/0512/18,二者相似性为98.6%,次要亲本株为新型GoAstV河南株AstV/HB02/Goose/0310/19,二者相似性为99.1%.表明GoAstV-GXHZ01-2022株与新型GoAstV参考株相似性最高,进化趋势也一致,并检测到重组现象.本研究为丰富GoAstV基因库中广西流行株全基因组序列信息提供基础数据.

    鹅星状病毒基因组分子特征

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    新孢子虫硫氧还蛋白的生物信息学分析及其原核表达的鉴定

    齐闻新张旻李晨周思含...
    691-699页
    查看更多>>摘要：为研究新孢子虫硫氧还蛋白(Trx)的生物学特性,本研究利用PCR扩增犬新孢子虫Trx(NcTrx)基因的编码区序列,构建pET-32a(+)-NcTrx原核表达载体,经双酶切与测序鉴定正确后,利用系列生物信息学软件分析NcTrx基因及其编码氨基酸序列的生物信息学特征,并对其蛋白互作网络中排名前100的蛋白进行GO功能和KEGG信号通路的富集分析.重组质粒中NcTrx基因的测序结果显示,NcTrx基因片段为1 287 bp,编码428个氨基酸;该蛋白含1个信号肽,1个跨膜区,主要位于内质网上;NcTrx蛋白的二、三级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲组成,有12个B细胞抗原表位;该蛋白属于硫氧还蛋白家族,存在典型的氧化还原基序"-CXXC-",有38个磷酸化位点、10个O-糖基化位点;与NcTrx蛋白互作最强的为酪氨酸激酶样蛋白,二者通过氢键和静电作用实现相互对接;GO功能及KEGG信号通路的显著性富集分析结果显示,NcTrx与其互作的蛋白主要参与蛋白质转运、蛋白质二硫键异构酶活性等生物学过程,与内质网蛋白质加工、硫代谢等信号通路密切相关.将pET-32a(+)-NcTrx转化BL21(DE3)感受态细胞,并经IPTG诱导表达后采用镍亲和层析法纯化重组NcTrx蛋白(rNcTrx),经SDS-PAGE检测该蛋白的表达及纯化效果,采用Bradford法测定纯化蛋白的浓度.采用western blot鉴定rNcTrx的反应原性.SDS-PAGE结果显示,rNcTrx分子量约66 ku,主要以包涵体的形式表达,且纯化效果较好,浓度为0.8 mg/mL.Western blot检测结果显示,纯化的rNcTrx能够与鼠His MAb、新孢子虫感染的小鼠血清发生特异性反应,在66 ku处出现特异性条带.本研究首次经PCR扩增NcTrx基因,对NcTrx基因及其蛋白进行了生物信息学分析,并经原核系统表达及鉴定了NcTrx蛋白,为后续深入探究该蛋白的生物学功能提供参考依据.

    新孢子虫硫氧还蛋白生物信息学原核表达

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    青海血蜱Haemalin基因的克隆、生物信息学及转录水平分析

    何永彩李增魁陈炳华张连生...
    700-708页
    查看更多>>摘要：为构建青海血蜱Haemalin基因的cDNA全长序列,并分析该基因的生物信息学特征及其在青海血蜱不同发育阶段和雌蜱不同组织中的转录水平,本研究基于青海血蜱唾液腺转录组文库中检索到的一个功能注释为Haemalin的基因片段,采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)引物设计软件设计Haemalin基因 3'RACE和5'RACE特异性引物,分别经RACE扩增青海血蜱Haemalin基因的3'端和5'端序列,测序后与其中间序列拼接获得该基因的cDNA全长序列.利用生物信息学软件分析该基因编码蛋白的信号肽、理化性质、跨膜结构域、结构域、蛋白质三级结构、B细胞抗原表位以及氨基酸序列比对,采用NCBI中的BLAST及MEGA 7.0软件分别分析Haemalin基因编码氨基酸序列的相似性及构建其系统进化树,采用qPCR检测Haemalin基因在不同发育阶段青海血蜱和雌蜱不同组织中的转录水平.结果显示,青海血蜱Haemalin基因cDNA全长583 bp,开放阅读框(ORF)423 bp,该基因编码蛋白的信号肽为N端的15个氨基酸,理论等电点4.71,属于亲水性蛋白,无跨膜结构域.该基因编码蛋白的三级结构分析结果显示,其存在两个典型的Kunitz/牛胰蛋白酶抑制剂(Kunitz/BPTI)结构域,两个结构域之间由单链连接,共包括3个α螺旋,2对反向平行的β折叠;在aa35～aa45、aa54～aa60、aa75～aa80、aa91～aa93、aa125～aa131等处可能存在潜在的B细胞抗原表位.相似性与进化树结果显示,青海血蜱Haemalin氨基酸序列与褐黄血蜱凝血酶抑制剂Haemalin氨基酸序列的相似最高达92%,并在进化树中二者处于同一进化分支.表明,青海血蜱Haemalin可能也为一种凝血酶抑制剂.qPCR结果显示,Haemalin基因在不同发育阶段青海血蜱中的转录水平为:卵>半饱血蜱>若蜱>饱血蜱>幼蜱>吸血96h的雌成蜱>游离雌成蜱,且其在青海血蜱雌蜱中肠中的转录水平极显著高于其他组织(P<0.0001).表明,Haemalin基因在青海血蜱成蜱吸血阶段及其在该蜱的血液消化中均发挥重要作用.本研究为进一步研究Haemalin基因的生物学功能及其在青海血蜱防控中的作用奠定基础.

    青海血蜱Haemalin基因克隆生物信息学转录水平

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    猪肺炎支原体P46-P65重组蛋白的表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

    杨振宇李璇刘一宁谢邵波...
    709-715页
    查看更多>>摘要：为建立猪肺炎支原体(Mhp)血清学调查及免疫评估方法,本研究利用DNAStar生物学软件对Mhp的P46和P65进行抗原表位分析,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)获得P46-P65融合基因,构建重组表达质粒pETP46-P65,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经诱导后获得了可溶性表达的重组P46(aa33～aa419)-P65(aa307～aa627)蛋白(rP46-P65).以纯化的rP46-P65为包被抗原,经优化各反应条件后建立了检测Mhp抗体的间接ELISA方法.特异性试验结果显示所建立的方法与CSFV、FMDV、PEDV、PCV2、PRV、PRRSV和APP等阳性血清均无交叉反应.该方法可检测到最高稀释至6 400倍的Mhp阳性血清,批内和批间变异系数均小于5%.利用IDEXX试剂盒和本研究建立的方法同时检测298份临床血清样品,前者的检测阳性率为62.4%(186/298),后者的检测阳性率为73.8%(220/298),两者检测结果的总符合率为88.6%.IDEXX检测为阳性的血清,采用本研究建立的ELISA方法检测也均为阳性;而部分Mhp阳性猪经IDEXX试剂盒检测为阴性的血清,该ELISA方法检测结果却为阳性,其中79.4%(27/34)检测结果有差异的血清经Mhp颜色变化试验证明均为阳性,表明本研究建立的ELISA方法的敏感性明显高于IDEXX方法.本研究建立的检测猪Mhp抗体的间接ELISA方法与目前广泛使用的方法相比优势明显,为临床血清流行病学调查及血清抗体水平评估提供了可行方法.

    猪肺炎支原体重组融合蛋白P46-P65间接ELISA

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    产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌聚合酶交联螺旋反应快速检测方法的建立

    王璊孟祥宇程静庞梦婷...
    716-722页
    查看更多>>摘要：为建立一种快速检测产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌(emetic Bacillus cereus)的新型、敏感且可视化的聚合酶交联螺旋反应(PCLSR)方法,本实验根据该菌结构性合成酶基因cesB设计特异性引物,通过对反应体系和反应条件的优化,初步建立了检测emetic B.cereus的PCLSR方法.结果显示,PCLSR方法在64℃反应50 min、dNTP浓度为0.3 mol/L、Bst聚合酶浓度为8U/管时获得最佳扩增效果.以 5株emetic B.cereus和12株临床常见菌的DNA作为模板,经本研究建立的该PCLSR方法检测,结果显示,PCLSR法能有效检测5株emetic B.cereus,而对其他相关细菌的检测结果均为阴性,表明该方法特异性较强.将emetic B.cereus 10倍倍比稀释(1×107 cfu/mL～1×100 cfu/mL)后采用该PCLSR法、LAMP法和荧光定量PCR(qPCR)方法检测,结果显示,PCLSR法和qPCR方法的检测限均达1×102 cfu/mL,LAMP法的检测限为1×103 cfu/mL,表明本研究建立的PCLSR法的敏感性较高.采用"国标"中的细菌培养法、PCLSR法、qPCR法及环介导等温扩增(LAMP)法同时检测 50 份人工污染emetic B.cereus的饲料及灭菌牛奶样品,结果显示,PCLSR法与qPCR法检测emetic B.cereus的阳性率为30%(15/50),阴性率为70%(35/50),二者的符合率均达100%;细菌培养法和LAMP法检测emetic B.cereus的阳性率为24%(12/50),阴性率为76%(38/50),二者与PCLSR法的总符合率均为80%.综上所述,本研究建立的PCLSR法具有较强的特异性、较高的敏感性,且不需要复杂设备和昂贵试剂即可在短时间内完成对emetic B.cereus的检测,该方法的建立为基层部门对emetic B.cereus的检测及该菌的流行病学调查提供了新的技术手段.

    蜡样芽孢杆菌聚合酶交联螺旋反应检测

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    药理激活p38/MAPK体外抗传染性喉气管炎病毒效应的检测

    崔露刘柘一张宇韩宗玺...
    723-730,746页
    查看更多>>摘要：鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)是一种严重危害我国和世界养禽业的重要病原.本研究以ILTV-LJS09株感染的鸡LMH细胞系作为研究模型,对该病毒的全基因组转录谱分析,采用基因富集分析(GSEA)分析细胞中的信号通路.结果发现MAPK通路是ILTV感染LMH细胞后最显著激活的通路.进一步采用western blot鉴定,结果显示ILTV感染可以显著激活宿主细胞p38/MAPK信号通路.本研究同时采用脱氢紫堇碱(DHC)和佛波酯(PMA)作为p38/MAPK激活剂,采用特异性荧光定量PCR检测病毒基因组拷贝数,通过测定病毒的TCID50检测病毒滴度,利用荧光定量PCR检测细胞中代谢相关基因的转录水平,使用高内涵成像技术结合Annexin V-FITC/碘化丙啶双染法检测细胞凋亡,从而探究药理激活p38/MAPK对ILTV感染的影响.病毒特异性荧光定量PCR检测结果显示,DHC和PMA均显著降低ILTV基因组的复制(P<0.05).TCID50测定结果显示,DHC和PMA还显著抑制ILTV感染性病毒粒子的增殖(P<0.05).荧光定量PCR检测结果显示,无论DHC还是PMA对感染细胞代谢基因的总体转录水平均无明显影响.高内涵成像技术检测结果显示,DHC和PMA显著加剧ILTV感染细胞的凋亡(P<0.05).综上所述,本研究结果显示DHC和PMA均能够在不影响感染细胞代谢基因表达的情况下,通过加剧ILTV感染细胞的凋亡有效抑制ILTV的感染.本研究在ILTV体外感染模型中证明药理激活p38/MAPK信号通路具有高效的抗病毒作用,为治疗ILTV的感染提供了新的思路,对其他疱疹病毒感染的防治研究也具有借鉴意义.

    传染性喉气管炎病毒p38丝裂原活化蛋白激酶转录谱凋亡

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    猪流行性腹泻病毒非结构蛋白NSP15抑制细胞焦亡的分子机制研究

    李鑫悦徐维律吕倩傅心雨...
    731-739页
    查看更多>>摘要：为探究猪流行性腹泻病毒(PEDV)及其NSP15蛋白对细胞焦亡的影响及初步的分子作用机制,本研究将表达pGSDMD-p30的质粒转染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2细胞),24h后将PEDV感染该细胞,于感染后12h和24h分别收集细胞上清液和细胞,采用LDH试剂盒测定各时间点细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH)的释放比例;采用qPCR检测细胞中GSDMD mRNA的转录水平.结果显示,各时间点,转染表达pGSDMD-p30质粒的IPEC-J2细胞中LDH的释放比例均极显著升高,表明细胞发生焦亡,且与转染pGSDMD-p30质粒的细胞相比,PEDV感染的细胞中LDH的释放比例及GSDMD mRNA的转录水平均极显著降低.将表达pGSDMD-p30的质粒分别与不同剂量的PEDV-NSP15 质粒共转染HEK293T细胞(pGSDMD-p30+NSP15 组);将表达Caspase-1、pGSDMD和表达NSP15的质粒分别共转染HEK293T和IPEC-J2细胞(Caspase-1+pGSDMD+NSP15组).上述细胞于24h后均测定各组细胞上清液中LDH的释放比例.结果显示,与pGSDMD-p30组(共转染表达pGSDMD-p30与空载体的细胞)相比,pGSDMD-p30+NSP15组HEK293T细胞及IPEC-J2细胞中LDH的释放比例均显著降低;与Caspase-1+pGSDMD对照组细胞相比,Caspase-1+pGSDMD+NSP15组细胞中LDH的释放比例极显著降低.上述结果表明,NSP15在不同细胞中均可以抑制GSDMD-p30及GSDMD+Caspase-1两种方式引起的细胞焦亡,提示PEDV可能通过NSP15抑制细胞的焦亡.将自噬抑制剂3-MA和蛋白酶体途径抑制剂MG132分别加入不同剂量的NSP15质粒与MYC-pGSDMD质粒共转染的HEK293T细胞中,6 h后采用western blot检测细胞中GSDMD的表达水平;将上述质粒共转染HEK293T细胞,24 h后通过qPCR检测细胞中GSDMD mRNA的转录水平.结果显示,随着NSP15转染剂量的增加,细胞中GSDMD的表达水平逐渐减少,加入3-MA和MG132并不影响GSDMD的表达水平;相比于共转染空载体和NSP15质粒的对照组,MYC-pGSDMD+NSP15组细胞中GSDMD mRNA的转录水平极显著降低.上述结果表明,PEDV NSP15降解GSDMD的过程不是通过自噬和蛋白酶体途径实现的.将4个核酸内切酶活性位点突变的NSP15质粒分别与pGSDMD-p30或pGSDMD质粒共转染HEK293T细胞,24 h后采用LDH试剂盒测定各组细胞上清中LDH的释放比例;采用western blot检测各组细胞中GSDMD的表达水平.结果显示,与p30组相比,H226、H241和K282突变组细胞上清中LDH的释放比例均无显著变化,而D265突变组细胞上清中LDH的释放比例极显著降低;H226、H241和K282突变组细胞中GSDMD的表达水平与阴性对照组细胞中GSDMD的表达水平相当,而D265突变组细胞中GSDMD的表达水平明显减少.上述结果表明,PEDV通过其NSP15蛋白抑制各种细胞的细胞焦亡,且本研究首次证明该蛋白通过其核酸内切酶活性位点H226、H241和K282降解GSDMD并抑制细胞焦亡,为PED的治疗和开发抗PED的药物提供参考.

    猪流行性腹泻病毒非结构蛋白15核酸内切酶细胞焦亡GSDMD

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