查看更多>>摘要:目的 在子宫内膜癌细胞系水平,进一步明确上调子宫内膜癌细胞内DJ-1 表达的重要调控机制.方法 1.利用正常人子宫内膜上皮细胞(ESC)和4 种子宫内膜癌细胞株,检测细胞中miR-128-2 基因启动子区DNA甲基化的水平、miR-128-2、DJ-1 mRNA及 DJ-1 蛋白表达水平,比较分析它们在不同的子宫内膜癌细胞系中的差异变化及相关性.2.将miR-128-2 mimic和miR-128-2 inhibitor依次分别转染Ishikawa和SPEC-2 子宫内膜癌细胞株,测定细胞中miR-128-2、DJ-1 mRNA及DJ-1 蛋白表达水平的变化,以求阐明miR-128-2 是否能调控内源性DJ-1 表达.3.分别构建含野生型DJ-1-3'UTR的重组荧光素酶报告载体pGL3-DJ-1-3'UTR-wt和含有突变型DJ-1-3'UTR的重组荧光素酶报告载体pGL3-DJ-1-3'UTR-mut,验证DJ-1 是否为miR-128-2 直接靶基因.4.Ishikawa和SPEC-2 子宫内膜癌细胞经 5μM甲基化抑制剂 5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-dC)药物预处理48h或5-Aza-dC预处理后再转染miR-128-2 inhibitor 48 h,随后检测miR-128-2 基因启动子DNA甲基化水平的变化、miR-128-2 和DJ-1 mRNA表达丰度的变化、DJ-1 蛋白的表达水平变化,以求阐明子宫内膜癌细胞中miR-128-2 基因启动子DNA甲基化是否沉默miR-128-2 表达进而上调DJ-1 表达.结果 1.与正常ESC相比较,Ishikawa、RL95-2、KLE及SPEC-2 四种子宫内膜癌细胞中miR-128-2 基因启动子区DNA甲基化水平均显著增加(P<0.01),同时miR-128-2 表达明显下调(P<0.01),而DJ-1 mRNA及蛋白表达显著增加(P<0.01);通过相关性分析发现miR-128-2 甲基化水平与miR-128-2 表达具有显著负相关性(r =-0.9124,P<0.01),而与DJ-1 mRNA表达具有显著正相关性(r = 0.8304,P<0.01);此外,miR-128-2 表达与DJ-1 mRNA的表达表现为负相关性(r =-0.8963,P<0.01).2.Ishikawa和SPEC-2 细胞中转染miR-128-2 inhibitor后,DJ-1 mRNA及蛋白表达水平较对照组均有明显升高(P<0.01),而miR-128-2 mimic转染细胞后,DJ-1 mRNA及蛋白表达水平较对照组均出现明显下降(P<0.01).3.miR-128-2 mimic 转染细胞后,重组报告质粒 pGL3-DJ-1-3'UTR-wt的荧光素酶活性大幅降低(P<0.01),但miR-128-2 mimic对重组报告质粒pGL3-DJ-1-3'UTR-mut的荧光素酶活性却无法产生作用(P>0.05),提示miR-128-2 可直接与DJ-13'UTR靶向结合.4.经 5μM甲基化抑制剂5-Aza-dC预处理 48h后,Ishikawa及 SPEC-2 细胞中 miR-128-2 甲基化水平均显著下降(P<0.01),miR-128-2表达均显著上升,而DJ-1 mRNA和蛋白表达水平均显著下降(P<0.01).此外,5-Aza-dC预处理上调miR-128-2 表达并下调DJ-1 mRNA和蛋白表达的作用可被miR-128-2 inhibitor所逆转(P<0.01),然而,5-Aza-dC预处理降低miR-128-2 甲基化水平的作用却未能被miR-128-2 inhibitor影响.结论 子宫内膜癌细胞中DJ-1 的表达可由miR-128-2 直接靶向负调控;miR-128-2 基因启动子区DNA甲基化致miR-128-2 表达沉默可能是子宫内膜癌细胞中上调DJ-1 表达的关键机制.