查看更多>>摘要:目的:探索新的体外构建血管网络的方法以解决工程化骨组织预血管化的问题.方法:冻存颌骨来源成骨细胞(human osteoblasts,HOBs)和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)用 0,5,25,50 μg/mL四氧化三铁纳米颗粒(Fe3O4 MNPs,magnetic nanoparticles)孵育;CCK-8试剂盒、普鲁士蓝染色检测不同浓度Fe3O4 MNPs对冻存颌骨来源HOBs和HUVECs生长、内吞的影响.采用50 μg/mL Fe3O4 MNPs孵育HOBs和HUVECs,第 0,1,3天用活/死细胞双染色试剂盒检测细胞存活情况.采用50 µg/mL Fe3O4 MNPs孵育HOBs和HUVECs不同时间(0,30 min,1 h,2 h)后,N41超磁铁皿底吸引,鬼笔环肽(phalloidin)细胞骨架染色检测HOBs和HUVECs贴壁成膜情况;采用50 μg/mL Fe3O4 MNPs孵育HOBs和HUVECs 1 h后,磁性吸引控制依次成膜,设置HOBs+HOBs 对照组,HOBs+HUVECs+HOBs 预血管化组;3,3-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate(DiO)和 1,1'-Di-octadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate(DiL)分别标记 HOBs 和 HUVECs 后荧光显微镜观测示踪,第3、7天利用Western blot、免疫荧光染色检测预血管化细胞膜片人骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP2)和血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)蛋白表达水平及染色阳性分布区域.结果:与细胞对照组相比,5 µg/mL组,25 µg/mL组,50 µg/mL Fe3O4 MNPs组HOBs和HUVECs生长无显著差异.与对照组相比,50 μg/mL Fe3O4 MNPs组HOBs和HUVECs纳米颗粒内吞明显,HOBs和HUVECs存活无差异.与未标记对照组及孵育30 min组相比,50 μg/mL Fe3O4 MNPs孵育HOBs和HUVECs 1 h和2 h组明显可见较多细胞贴壁成膜.与HOBs+HOBs对照组相比,HOBs+HUVECs+HOBs预血管化组呈现明显三明治状分层结构,膜片厚度明显增加,VEGF-A和BMP2蛋白表达及染色阳性显著增加.结论:通过纳米颗粒标记并磁性吸引成膜,体外形成预血管化成骨细胞膜片,为优化构建预血管化的骨组织提供了新的理论指导.