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期刊信息/Journal information
农业生物技术学报
中国农业大学 中国农业生物技术学会
农业生物技术学报

中国农业大学 中国农业生物技术学会

武维华

月刊

1674-7968

nsjxb@cau.edu.cn

010-62733684

100193

北京海淀区圆明园西路2号中国农业大学生命科学楼1053室

农业生物技术学报/Journal Journal of Agricultural BiotechnologyCSCD北大核心CSTPCD
查看更多>>《农业生物技术学报》创刊于1993年，由中华人民共和国教育部主管，中国农业大学与中国农业生物技术学会共同主办，是一份为农业生物技术研究与发展提供服务的科学期刊。现任主编武维华院士，著名的植物生理学与生物化学家。主要刊登与农业科学有关的植物、动物、微生物及林业、海洋等学科在组织、器官、细胞、染色体、蛋白质、基因、酶、发酵工程等不同水平上的农业生物技术研究成果；刊登与农业有关的遗传与育种、生理、生化与分子生物学、环境与生态、医学、病理学等与基础与应用基础研究成果。
正式出版
收录年代

    基因编辑外源基因Cas9定性定量检测方法的研究

    丁霖王颢潜张敏王雨玲...
    1855-1868页
    查看更多>>摘要：对基因编辑产品进行有效监管、消除公众疑虑是基因编辑产品在我国产业化的前提.目前,Cas9核酸内切酶是基因编辑技术中最常用的手段,因此需要建立针对Cas9核酸内切酶的定性定量检测方法.本研究以基因编辑中最常用的Cas9核酸内切酶外源序列为靶位点,设计和筛选引物、探针,进行PCR体系优化,确定最佳的引物浓度与退火温度,通过特异性、灵敏性等测试建立了检测基因编辑外源基因Cas9的普通PCR和qPCR检测方法.在检测方法特异性实验中,普通PCR和qPCR方法均只在含有Cas9等外源DNA的样品中扩增出了阳性结果,而其他不含有Cas9核酸内切酶的样品则均为阴性结果;在方法灵敏性测试中,普通PCR检测方法的检出限为0.1％,qPCR法检测下限(limit of detection,LOD)为16个拷贝;在方法稳定性实验中,普通PCR和qPCR方法在其相应最低检出限浓度下分别进行了67与60次重复实验,结果均为阳性.该定性定量方法适用于不同基因编辑作物,如水稻(Oryza sativa)、大豆(Glycine max)和油菜(Brassica napus)等.本研究建立的Cas9定性及定量检测方法特异性良好、灵敏度较高、稳定性较强.该方法的建立为将来实现对基因编辑产品的有效监测提供了一定的技术支撑.

    基因编辑技术常规PCRqPCRCas9

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    铁皮石斛白绢病响应miR171b及miR171b靶标DcGRAS基因家族的鉴定及表达分析

    赖丹妮蔡翔陈东红韩之刚...
    1869-1883页
    查看更多>>摘要：铁皮石斛(Dendrobium catenatum)是多年生草本药用植物,具有益胃生津的功效.白绢病是翠雀小核菌(Sclerotium delphinii)引发的一种广谱性真菌病害,在铁皮石斛近野生栽培中一旦发病可造成全年绝收,危害巨大.本研究对翠雀小核菌侵染后的铁皮石斛进行Small RNA组和转录组测序,筛选到受microRNA171b(miR171b)调控并响应翠雀小核菌侵染的靶基因DoNSPL2-2和DoNSPL2-5,在翠雀小核菌侵染后,DoNSPL2-2与DoNSPL2-5的表达显著提高(P<0.05).采用生物信息学对铁皮石斛GRAS(gibberellic acid insensitive(GAI),repressor of GAI(RGA),and scarecrow(SCR))基因家族成员进行了鉴定和分析.结果显示,铁皮石斛51个GRAS基因家族成员被分为11个亚族,其蛋白质序列长度为345～757个氨基酸;蛋白质的相对分子质量范围为39.2740～85.6616 kD,蛋白质理论等电点为4.59～7.52,均含有GRAS保守结构域.转录组数据显示,DoNSPL2-2与DoNSPL2-5在铁皮石斛的根中表达显著上调(P<0.05);干旱胁迫中,DoSCL21-2与DoSCL3-3的表达量随时间延长而显著上调(P<0.05);低温胁迫中,DoCIGR1与DoSCL23-like的表达量较对照组显著上调(P<0.05).本研究对铁皮石斛miR171b及其靶基因GRAS家族进行了分析,初步阐明了miR171b-GRAS调控模型参与调控铁皮石斛防御白绢病的分子机制,为铁皮石斛抗白绢病育种提供理论依据.

    铁皮石斛GRAS转录因子白绢病抗病育种microRNA171b(miR171b)

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    牛恒定链与BoLAⅡ类分子β链活性片段的结合与定位分析

    陈芳芳于凤梅张俊谈阳...
    1884-1893页
    查看更多>>摘要：牛白细胞抗原(bovine leukocyte antigen,BoLA),又名主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC),其Ⅱ类分子及其伴侣蛋白恒定链(invariant chain,Ii)在加工和递呈抗原肽中起关键作用.为了解在此过程中BoLAⅡβ链与Ii结合和在细胞内定位的特征,本研究提取了淮北黄牛(Bos taurus)血细胞mRNA并反转录为cDNA,应用PCR技术扩增牛Ii与BoLAⅡβ链及结构域的基因片段,并分别构建相应的真核和原核表达质粒.利用原核表达系统进行蛋白的表达和纯化,应用拉下法和Western blot检测Ii结合BoLAⅡβ及其片段的结合关系.应用激光共聚焦显微镜观察Ii与BoLAⅡβ链及其片段在细胞内共定位.结果显示,构建的含牛Ii、BoLAⅡβ、BoLAⅡβ(β1β2)和BoLAⅡβ(TC)基因的重组质粒转化细菌,经诱导能正确表达蛋白并得到纯化.BoLAⅡβ和BoLAⅡβ(β1β2)具有结合Ii的活性功能,而BoLAⅡβ(TC)却无此功能.同时,在真核细胞内Ii能与BoLAⅡβ及其主要结构域BoLAⅡβ(β1β2)和BoLAⅡβ(TC)共定位.综上所述,BoLAⅡβ的β1β2是结合Ii的关键结构域,而BoLAⅡβ的β1β2和TC结构域均具有与Ii在细胞内共定位功能.本研究为进一步研究牛BoLA分子与Ii在免疫应答中的转运及其机理提供了重要实验依据.

    牛恒定链(Ii)牛白细胞抗原(BoLA)结合共定位

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    牛精浆中氨基酸含量与精子活力的关联性分析

    李欣韩碧莹杨明张学丽...
    1894-1902页
    查看更多>>摘要：精液冷冻保存在良种选育中发挥重要作用,但是精液冷冻会引起精子损伤.为了探寻精浆中决定精子冷冻耐受能力的关键因子,本研究采集了5头鲁西牛(Bos taurus)和5头蒙古牛的精液,系统地检测分析了精液体积、精子密度、精子活力等指标并通过HPLC技术定量分析了鲁西牛和蒙古牛的精浆中各氨基酸的含量.研究结果显示,10头牛的精液体积平均为4.85 mL,精子密度平均为13.76亿个/mL,鲜精和冻精活力分别为69.67％和35.68％,精浆中总氨基酸浓度为25～54 mg/mL,且蒙古牛高于鲁西牛;精浆中各氨基酸浓度与精子活力相关性分析结果表明,酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、丝氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)的浓度与冻精活力存在显著相关性,Pearson相关系数r值分别为0.743、0.755、0.662、0.649、0.725、0.729(P<0.05),脯氨酸(Pro)的浓度与冻精活力存在极显著相关性(r=0.768,P<0.01).综上可知,精浆中氨基酸含量的检测可以作为牛精子冷冻耐受能力评价的潜在指标.本研究为冷冻精液质量的进一步提高提供了理论依据.

    牛精液精浆氨基酸精子活力精液冷冻

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    Myostatin基因编辑牛骨骼肌组织学结构与转录组分析

    朱琳谷明娟王丽娜刘哲...
    1903-1912页
    查看更多>>摘要：肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)主要在骨骼肌中表达,参与调控骨骼肌的生长发育.MSTN基因突变引起肌肉过度发育,出现双肌表型.本研究以MSTN基因编辑的鲁西牛(Bos taurus)骨骼肌为材料,探究MSTN敲除后对牛肌肉表型的影响,通过转录组挖掘MSTN基因调控肌肉发育的机制.分别取比目鱼肌、腓肠肌、半腱肌和最长肌4种典型的骨骼肌,通过4种骨骼肌的苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)切片,观察MSTN基因敲除后对骨骼肌的影响,qRCR、Western blot检测4种骨骼肌中MSTN mRNA和蛋白表达量,最后通过转录组分析,探究MSTN敲除后对鲁西牛骨骼肌作用机制的靶基因.结果表明,与普通鲁西牛相比,MSTN基因编辑牛骨骼肌的肌纤维横截面积显著增大,肌间脂肪显著减少.转录组测序结果显示,MSTN基因编辑牛和普通牛的骨骼肌之间共鉴定出5945个差异表达基因表达(FC>1.5,P<0.05),其中在MSTN基因编辑牛骨骼肌中表达量上调基因有672个,有表达量下调基因5273个;这些差异基因主要集中在PI3K-Akt、MAPK、p53和AMPK等信号通路,参与肌卫星细胞增殖与分化等发育过程.研究表明,MSTN基因缺失促进了肌肉发育与分化相关基因的表达调控,增加了骨骼肌纤维的横截面积,由此产生肌肉肥大的表型.本研究为探究MSTN基因缺失牛骨骼肌肥大机制提供数据支持.

    肌肉生长抑制素(MSTN)基因编辑牛转录组骨骼肌

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    皮南牛与南阳牛脂肪组织差异表达lncRNA筛选及其调控网络构建

    朱运昌闪欣悦王豪靖赵雅迪...
    1913-1925页
    查看更多>>摘要：长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)已知参与脂肪形成,但是其分子机制仍未明确.为进一步探索lncRNAs在脂肪沉积过程中的潜在作用,为肉牛(Bos taurus)改良提供理论基础,本研究利用高通量RNA测序技术在南阳牛和皮南牛背脂中共鉴定了3040个lncRNAs,其中两种牛共同表达的lncRNAs有3008(98.9％)个.特征性分析发现,大多数(66.02％)lncRNAs长度集中在1000～2500 bp之间,且在所有染色体中均有分布;差异性表达分析显示,皮南牛与南阳牛相比共有67个差异表达的lncRNAs,其中32个上调,35个下调.GO分析结果显示,差异表达的lncRNAs主要富集在脂类转运过程、膜的组成成分、脂质抗原结合等相关生物过程.KEGG通路分析显示,这些差异表达的lncRNAs基因主要富集在甘油磷脂代谢、醚脂代谢、甘油酯代谢、碳水化合物消化吸收等通路.为了探究lncRNA作用机制,初步构建了lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,结果发现,LOC104972839/LOC107131703-miR-27b-磷脂酶A2组IVF(phospholipase A2 group IVF,PLA2G4F)/包含2A的主要促进子超家族结构域(major facilitator superfamily domain containing 2A,MFSD2A)可能与脂肪酸降解及脂肪沉积有重要关联,可作为候选目标进行脂肪发育机制研究.为了检测测序结果的可靠性,利用qRT-PCR进行表达水平鉴定,并利用在线软件进行编码能力预测,结果显示,差异表达lncRNAs表达水平与测序结果一致,且编码能力很低.本研究为脂肪沉积相关的lncRNA的发现和注释提供了新的见解,并为进一步阐明牛脂肪沉积的分子调控机制提供依据.

    长链非编码RNA(lncRNA)内源竞争RNA(ceRNA)牛脂肪RNA测序

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    热应激应答过程中酪蛋白来源的环状RNA表达谱分析

    齐颖解春艳刑静李秋玲...
    1926-1935页
    查看更多>>摘要：热应激会导致牛乳中酪蛋白含量减少,降低牛乳品质.本研究拟鉴定参与热应激应答的酪蛋白基因来源的环状RNA,为今后阐明热应激导致酪蛋白表达减少的分子机制提供理论依据.本课题组前期工作通过RNA-seq获取了环状RNA在非热应激及热应激奶牛(Bos taurus)乳腺组织中的表达数据.本研究随机挑选4个环状RNA,通过Sanger测序法验证了其反向剪接位点的存在;通过实时荧光定量PCR技术验证了其在非热应激及热应激组中的相对表达水平,所得结果与高通量测序分析结果一致.酪蛋白的编码基因包括αs1酪蛋白(casein alpha s1,CSN1S1)、αs2酪蛋白(CSN1S2)、β酪蛋白(casein beta,CSN2)以及κ酪蛋白(casein kappa,CSN3).通过统计分析环状RNA的宿主基因数据,分别统计了来源于各个编码基因的环状RNA,通过聚类热图及韦恩图展示了这些环状RNA在不同样本及不同组别中的表达模式.最后,通过RNA-seq的TPM(transcripts per million)数据分析了酪蛋白基因来源的环状RNA的相对表达水平.本研究鉴定出源于酪蛋白基因的环状RNA共52个,其中来源于CSN1S1、CSN1S2和CSN2的环状RNA种类分别为29、16和7个,未检测到来源于CSN3的环状RNA.这些环状RNA中,与非热应激组相比,显著上调的环状RNA有5种,其中3种在热应激条件下特异性表达.所鉴定的酪蛋白来源的环状RNA,在热应激应答过程中显著差异表达(P<0.05),可能参与了热应激应答过程的乳蛋白合成调控.本研究鉴定了热应激应答过程中酪蛋白来源的环状RNA差异表达谱,有助于阐明热应激导致牛乳中酪蛋白含量减少的分子机制,为提高牛乳品质提供了理论依据.

    环状RNA热应激牛乳αs1酪蛋白(CSN1S1)αs2酪蛋白(CSN1S2)β酪蛋白(CSN2)

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    雌二醇和孕酮对LPS诱导的犬子宫内膜基质细胞TLR4及炎性因子表达的影响

    倪珺邱靖淇李瑾冯忆秋...
    1936-1943页
    查看更多>>摘要：子宫蓄脓是母犬(Canis lupus familiaris)常见的生殖疾病之一,其主要诱因包括激素分泌异常和细菌感染.子宫内膜是激素应答的靶器官,子宫内膜细胞的异常活化会导致大量炎性因子释放,引起炎症反应,然而在炎症环境下类固醇激素对犬子宫内膜基质细胞的免疫调控作用知之甚少.本研究旨在探讨类固醇激素雌二醇(estradiol,E2)和孕酮(progesterone,P4)调控体外培养的犬子宫内膜基质细胞(endometrial stromal cells,ESCs)Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)及相关炎性因子的分泌规律.临床采集子宫蓄脓犬和健康犬的外周血血清,利用ELISA方法检测血清中E2和P4的浓度;应用胶原酶消化法分离获取健康犬子宫内膜基质细胞并进行免疫荧光鉴定;以检测到的E2(0.2 nmol/L)和P4(0.1μmol/L)作用于细胞,利用噻唑蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)法测定E2和P4对细胞体外生长的影响;再分别与1μg/mL的细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)共同处理细胞,通过qPCR检测LPS诱导6、12和24 h犬子宫内膜基质细胞中TLR4和炎性因子的基因表达.免疫荧光鉴定结果显示,犬子宫内膜基质细胞纯度较高.MTT检测结果显示,P4单独作用及E2和P4联合处理能显著促进细胞的体外增殖.qPCR结果显示,与对照组相比,LPS刺激后TLR4和炎性因子的基因表达量均显著上调(P<0.05);与LPS组相比,P4单独处理与E2和P4联合处理可显著下调LPS刺激引起的TLR4和炎性因子基因过量表达(P<0.05).上述结果提示E2和P4可能在子宫内膜的免疫调节中发挥重要作用.本研究为阐明子宫蓄脓发生的分子机制及E2和P4对子宫内膜先天性黏膜免疫的影响提供基础资料.

    犬子宫内膜基质细胞(ESCs)雌二醇(E2)孕酮(P4)Toll样受体4(TLR4)炎性因子

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    双峰驼FcαR基因的原核表达、抗体制备及其在脾脏中的表达模式

    李沛轩刘晓霞刘丽萍王雯慧...
    1944-1953页
    查看更多>>摘要：免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)Fc受体(Fc receptor,FcαR)能够介导细胞发生免疫活化或免疫抑制,对维持机体免疫应答的稳态具有重要意义.双峰驼(Camelus bactrianus)脾脏作为FcαR主要表达部位之一,能够使机体迅速产生相应的免疫反应.本研究通过制备双峰驼FcαR多克隆抗体,并以幼年(1～2岁)、青年(3～5岁)和成年(6～8岁)双峰驼脾脏作为研究对象,探索FcαR阳性细胞在脾脏红髓区、白髓区及边缘区中的表达情况及其随年龄变化特征.首先截选出双峰驼FcαR的膜外区基因序列,合成后构建重组质粒,将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta感受态细胞中中诱导表达,并对诱导条件进行优化.接着用纯化的FcαR蛋白免疫家兔(Oryctolagus cuniculus),制备多克隆抗体,采用ELISA、Western blot测定抗血清的效价和特异性.最后应用免疫组织化学染色、苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)分析FcαR阳性细胞在不同年龄段双峰驼脾脏不同区域的分布特征,并对不同年龄段和不同区域的FcαR阳性细胞密度进行分析.结果发现FcαR质粒以包涵体的形式表达,最佳诱导条件为0.7 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导5 h,杂蛋白最佳洗脱浓度为5 mmol/L咪唑,抗血清效价达到1:64000,能特异性识别重组蛋白FcαR.FcαR阳性细胞在幼年、青年和成年双峰驼脾脏的分布位置相似,均集中分布于红髓区的窦壁和中央动脉管壁周围,阳性细胞类型以单核/巨噬细胞为主,中性粒细胞和树突状细胞上也有表达.此外,从双峰驼幼年到成年这一阶段,脾脏中FcαR阳性细胞密度呈明显的升高趋势.结果提示:FcαR阳性细胞在双峰驼脾脏中的表达部位不受年龄的影响,并且随着年龄的增长,脾脏中阳性细胞数量的增多为其免疫功能的完善提供了一定的生理基础.本研究可为进一步探索双峰驼免疫学功能提供参考.

    双峰驼免疫球蛋白AFc受体(FcαR)原核表达抗体制备脾脏免疫组化

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    农华麻鸭脑组织多胺含量及其代谢相关基因表达的研究

    康丽鹃周雪敏但红颖葛凡滋...
    1954-1961页
    查看更多>>摘要：多胺主要包括腐胺、亚精胺和精胺,可参与调控神经系统发育和再生.为研究鸭(Anas platyrhynchos)脑组织多胺代谢发育性变化规律,本研究采用高效液相色谱技术,测定0～120日龄的农华麻鸭大脑和小脑组织多胺含量,应用qPCR检测多胺代谢关键基因表达量.结果表明,大脑和小脑中亚精胺和精胺含量均高于腐胺,且随着日龄增长多胺总量呈下降趋势.在大脑中,60日龄腐胺含量(30.80 mg/kg)显著高于其他日龄(P<0.05),0日龄亚精胺含量(643.26 mg/kg)显著高于其他日龄(P<0.05),0日龄精胺含量(1665.95 mg/kg)和120日龄精胺含量(1623.66 mg/kg)显著高于其他日龄(P<0.05).在小脑中,0日龄亚精胺含量(54.09 mg/kg)和精胺含量(413.50 mg/kg)显著高于其他日龄(P<0.05),0日龄腐胺含量(26.46 mg/kg)和120日龄腐胺含量(22.03 mg/kg)显著高于其他日龄(P<0.05).大脑和小脑中多胺代谢基因均在0日龄时高表达(P<0.05).大脑多胺代谢关键基因表达量均呈30日龄时下降,60日龄升高,90日龄下降,120日龄上升的趋势.小脑中,各基因表达水平在0日龄时表达量均处于较高水平,表达量变化趋势不一致.本研究揭示了不同日龄的鸭脑组织中多胺含量变化规律及多胺合成代谢关键基因表达水平,为多胺调控脑生长发育提供基础数据.

    多胺多胺代谢基因表达大脑小脑

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