查看更多>>摘要:目的:构建人源靶向特异INTU-siRNA质粒,转染人源性甲状腺Nthy-ori-3-1细胞以构建INTU基因沉默的Nthy-ori-3-1细胞模型,为探索Graves病的发病机制提供合适的细胞模型.方法:构建四对人源INTU序列(编号分别为INTU-29、INTU-31、IN-TU-33、INTU-35)siRNA质粒和空载体质粒,将空载体和四对INTU-siRNA质粒分别转染Nthy-ori-3-1细胞培养24h,通过倒置荧光显微镜观察质粒转染细胞后的荧光表达,使用多功能酶标仪检测荧光强度,通过荧光定量PCR法验证INTU基因的沉默效率,通过蛋白质免疫印迹法验证各组细胞内INTU蛋白的表达水平,筛选沉默INTU基因效率最佳的质粒.结果:空载体和IN-TU-siRNA 质粒转染入Nthy-ori-3-1细胞24 h后,倒置荧光显微镜和荧光酶标仪检测结果显示空载体和四组INTU-siRNA组呈现绿色的荧光表达,与正常组相比,空载体与四组INTU-siRNA组的荧光强度均显著高于正常组(P<0.01),提示质粒均转染成功.荧光定量PCR结果显示,与正常组和空载体组相比,四组INTU-siRNA组的INTU基因mRNA相对表达量均显著降低(P<0.01),其中INTU-35组表达降低最显著,INTU的mRNA表达降低了 61.02%.蛋白质免疫印迹法结果显示,与正常组和空载体相比,INTU-29组和INTU-31组并无显著降低,INTU-33和INTU-35组较正常组和空载体组明显下降(P<0.05,P<0.01),其中IN-TU-35组最佳,INTU的蛋白表达降低了 44.54%.以上结果提示INTU-35组沉默INTU基因效果最佳.结论:本研究成功构建INTU-siRNA质粒,并将该质粒成功转染人源甲状腺Nthy-ori-3-1的细胞模型.INTU-siRNA甲状腺细胞模型的构建,为进一步探索Graves病的发病机制奠定了实验基础.