期刊,生物工程学报 2022年卷2期_国家学术搜索

期刊信息/Journal information

生物工程学报

主　　编：杨胜利

出版周期：月刊

国际刊号：1000-3061

电子邮箱：cjb@im.ac.cn

电　　话：010-64807509

邮政编码：100101

地　　址：北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所B401

生物工程学报/Journal Chinese Journal of BiotechnologyCSCD北大核心CSTPCD

查看更多>>《生物工程学报》是国内外公开发行的全国性学术期刊, 由中国科学院微生物研究所和中国微生物学会共同主办。主要报道生物工程研究的新发展、新成果、新技术。刊登的内容包括：基因工程、细胞工程、酶工程、生化工程、组织工程、生物信息、生物制药、生物芯片等。栏目设有：综述、研究报告、研究简报、技术与方法等。《生物工程学报》创刊于1985年。20多年来，本刊始终以推动生命技术发展和促进国家经济建设为宗旨，及时报道我国生物工程方面的重要研究成果, 有力地促进了国内在这一领域的学术交流，为科研教学和经济建设发挥了积极的作用。本刊已被美国<CA>,<BA>，<MEDLINE>,及<俄罗斯文摘>、中国生物学文摘、中国科学引文数据库、万方数据库、中国科技期刊光盘版等检索系统收录，是中国自然科学核心期刊。

正式出版

收录年代

高效合成葡萄糖二酸酿酒酵母工程菌的构建

李杰赵运英邓禹

705-718页

查看更多>>摘要：葡萄糖二酸是天然存在的一种重要二元酸,其在医疗保健和化工工业等领域具有很高的实际应用价值,因此被称为"最具价值的生物炼制产品之一".以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为底盘微生物,文中考察了过量表达肌醇转运蛋白Itr1、融合表达肌醇加氧酶和葡萄糖醛酸脱氢酶以及弱化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1三种策略对葡萄糖二酸产量的影响.研究结果显示,过量表达肌醇转运蛋白Itr1使葡萄糖二酸产量在摇瓶发酵条件下较出发菌株Bga-3提高了26％;MIOX4-Udh融合蛋白的表达使葡萄糖二酸的产量较Bga-3菌株提高了40％;在此基础上,弱化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1后,葡萄糖二酸的产量达5.5 g/L,较相同发酵条件下Bga-3菌株提高了60％.在5L发酵罐中,该菌株葡萄糖二酸的最高产量达10.85 g/L,较Bga-3菌株提高了80％.由此可见,上述代谢改造策略的应用在很大程度上提高了葡萄糖二酸的途径效率和产量,为通过代谢工程方法在酿酒酵母中合成其他化合物的研究提供了参考.

关键词：

酿酒酵母葡萄糖二酸肌醇转运蛋白融合表达代谢改造

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基于CRISPR/dCpf1的氧化葡萄糖酸杆菌转录抑制系统的构建与应用

杨宇彤李宁周景文陈坚...

719-736页

查看更多>>摘要：氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)因具有快速不完全氧化糖醇化合物的能力而被广泛应用于工业中.然而,适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因编辑工具较为缺乏,科研人员对其进行代谢改造受到很大的限制.近年来,规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)系统在基因组编辑和转录调控中的应用极大地提高了微生物基因组的编辑效率.为了实现氧化葡萄糖酸杆菌的转录调控,本研究构建了由CRISPR/dCpf1介导的基因转录抑制系统.通过在氧化葡萄糖酸杆菌表达失活的Cpf1蛋白(dCpf1)和含有19 nt重复序列的crRNA,使得该系统在基因转录中表现出有效的抑制效果,其对于单基因的抑制水平最高可达97.9％,且可同时应用于多基因的抑制并表现出很强的抑制能力.为了验证dCpf1介导的CRISPR干扰(CRISPR interference,CRISPRi)系统在代谢工程中的应用效果,将该系统应用于L-山梨糖的代谢途径和呼吸链的调控中,对山梨糖代谢途径关键脱氢酶进行了鉴定,确定了细胞色素bo3氧化酶对细胞生长的作用.该CRISPRi系统的开发有效填补了目前氧化葡萄糖酸杆菌中基因调控方法的短缺,为代谢工程改造氧化葡萄糖酸杆菌提供了有效的基因调控工具.

关键词：

氧化葡萄糖酸杆菌L-山梨糖基因编辑CRISPRi

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URA3基因影响青蒿酸酿酒酵母工程菌中试发酵产量

郭未蔚艾丽梅胡栋陈亚军...

737-748页

查看更多>>摘要：CRISPR/Cas9基因编辑技术已经被广泛应用于工程酿酒酵母的基因插入、基因替换和基因敲除,通过使用选择标记进行基因编辑具有简单高效的特点.前期利用CRISPR/Cas9系统敲除青蒿酸生产菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 1211半乳糖代谢负调控基因GAL80,获得菌株S.cerevisiae 1211-2,在不添加半乳糖诱导的情况下,青蒿酸摇瓶发酵产量达到了740 mg/L.但在50 L中试发酵实验中,S.cerevisiae 1211-2很难利用对青蒿酸积累起到决定性作用的碳源-乙醇,青蒿酸的产量仅为亲本菌株S.cerevisiae 1211的20％-25％.我们推测因遗传操作所需的筛选标记URA3突变,影响了其生长及青蒿酸产量.随后我们使用重组质粒pML104-KanMx4-u连同90 bp供体DNA成功恢复了URA3基因,获得了工程菌株S.cerevisiae 1211-3.S.cerevisiae 1211-3能够在葡萄糖和乙醇分批补料的发酵罐中正常生长,其青蒿酸产量超过20 g/L,与亲本菌株产量相当.研究不但获得了不加半乳糖诱导的青蒿酸生产菌株,同时首次发现了营养缺陷型标记URA3基因显著影响乙醇补料的中试发酵中青蒿酸的产生,也为酵母作为底盘来进行其他天然产物的生产提供了借鉴.

关键词：

工程酿酒酵母青蒿酸CRISPR/Cas9URA3

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环糊精葡萄糖基转移酶182位点定点改造催化合成糖基化染料木素

柴宝成姜钰琳倪晔韩瑞枝...

749-759页

查看更多>>摘要：染料木素及其单糖苷衍物在食品和医药领域具有重要作用,但难溶于水的特性极大地限制了其应用范围,研究表明糖基化反应可有效提高其水溶性.文中针对来源于软化芽孢杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶,研究其对染料木素单糖苷衍生物槐角苷的糖基化反应.通过对D182位点的定点饱和突变,突变酶D182C较WT转化率提高了13.42％,主要糖基化产物(槐角苷单糖苷、二糖苷、三糖苷)分别提高了39.35％、56.05％和64.81％.酶学性质研究发现,D182C较WT的环化、水解、歧化活力均有所提高.且最适pH和温度分别为6和40℃.动力学研究发现,D182C针对底物(糖基供体和受体)的Km值较WT均有所降低,且催化效率kcat/Km则明显提高,说明D182C对底物的亲和力相较于WT有大幅提升.同源建模及分子对接结果表明,突变酶D182C糖基化效率提高的原因可能与底物作用力增加有关.

关键词：

染料木素槐角苷环糊精葡萄糖基转移酶水溶性定点饱和突变糖基化反应

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多形汉逊酵母代谢改造生产脂肪酸及发酵条件优化

冯叨高教琪龚志伟周雍进...

760-771页

查看更多>>摘要：脂肪酸作为一种化工原料,在生物能源、化妆品、个人护理产品和工业润滑剂等领域具有广泛应用.多形汉逊酵母因其能够利用甲醇、耐高温、底物谱广等优点,被认为是微生物细胞工厂的理想底盘宿主.本研究首先通过代谢工程构建了产脂肪酸的汉逊酵母细胞工厂.在此基础上,通过发酵条件优化进一步提升了工程菌株生产性能.在温度37℃、pH 6.4、培养基碳氮摩尔比为120、种子液OD600在6-8之间时,摇瓶中工程菌脂肪酸产量达到1.86 g/Lo在发酵罐中,采用溶氧(DO)关联法控制补料速度,初始培养基碳氮摩尔比为17.5,在DO高于30％时,补料碳氮摩尔比为120的葡萄糖培养基,脂肪酸产量达到18.0 g/L,显示了汉逊酵母作为脂肪酸合成细胞工厂的潜力,为实现工业化奠定了坚实的理论与应用基础.

关键词：

多形汉逊酵母代谢工程脂肪酸限氮发酵发酵条件优化

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CRISPR/dCas9干扰bcsD基因表达调控细菌纤维素结构

黄龙辉李雪晶孙雪文王旭...

772-779页

查看更多>>摘要：木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)是细菌纤维素的主要生产菌株.在该菌中,BcsD是纤维素合酶的亚基之一,参与细菌纤维素的组装过程.利用CRISPR/dCas9系统调控bcsD基因的表达量,获得了一系列bcsD基因表达量不同的木葡糖酸醋杆菌.通过分析细菌纤维素的结构特征发现,细菌纤维素的结晶度和孔隙率随着木葡糖酸醋杆菌中bcsD表达量的变化而发生改变.其中孔隙率的变化范围在59.95％-84.05％之间,结晶度的变化范围在74.26％-93.75％之间,而细菌纤维素的产量并未因bcsD的表达量变化而发生显著下降.结果表明,bcsD的表达量低于55.34％后,细菌纤维素的孔隙率显著上升,并且细菌纤维素的结晶度与bcsD的表达量呈正相关.最终,通过干扰bcsD基因的表达,实现了一步发酵木葡糖酸醋杆菌获得了产量稳定且结构不同的细菌纤维素.

关键词：

CRISPR/dCas9木葡糖酸醋杆菌细菌纤维素bcsD

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谷氨酸棒杆菌中基于CRISPR/Cas9的多位点碱基编辑系统的优化

卢挥张启于思礼王钰...

780-795页

查看更多>>摘要：作为新型的基因组编辑工具,碱基编辑技术结合了CRISPR/Cas系统的定位功能和碱基脱氨酶的编辑功能,可实现特定位点的碱基突变,具有不产生双链DNA断裂,无需外源模板且不依赖染色体DNA同源重组的优势.目前,研究者们已在重要的工业生产菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中开发了多种碱基编辑工具,并实现了两基因和三基因的同时编辑.文中针对谷氨酸棒杆菌中基于CRISPR/Cas9的多位点碱基编辑系统中存在的不足(多重sgRNA结构烦琐、重复序列干扰、更换靶点困难等),采用多种策略进行优化,并比较碱基编辑效率:首先优化基于单独启动子/终止子的多重sgRNA表达框,通过构建框架质粒,并结合Golden Gate连接方法,加速靶点更换,避免重复序列干扰,虽然该方法sgRNA结构烦琐,但编辑效率最高;同时,开发基于Type Ⅱ CRISPR crRNA阵列、tRNA加工的多重gRNA表达框,这两种形式均只需要一个启动子和一个终止子序列,极大地简化了表达框结构,虽然编辑效率均出现下降,但仍具有一定的实用性.该研究丰富了谷氨酸棒杆菌的基因组编辑工具,为该菌株的遗传改造提供了更多的技术支持.

关键词：

碱基编辑谷氨酸棒杆菌CRISPR/Cas系统多重gRNA

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产麦角硫因大肠杆菌工程菌株的构建与优化

王丽王阳李江华堵国成...

796-806页

查看更多>>摘要：麦角硫因(ergothioneine,ERG)是一种天然的抗氧化剂,广泛应用于化妆品、食品以及医药领域.相比于传统植物提取和化学合成方法,微生物发酵合成麦角硫因具有周期短、成本低等优点,因而受到广泛关注.为构建高产麦角硫因的大肠杆菌工程菌株,本研究以大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)为出发菌株,通过引入耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)来源的麦角硫因合成基因簇egtABCDE以及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)来源的Egt1,构建了从头发酵合成麦角硫因的工程菌株E1-A1,麦角硫因发酵浓度为(95.58±3.20) mg/L.为进一步提高麦角硫因的产量,对前体氨基酸组氨酸、甲硫氨酸以及半胱氨酸合成路径中关键酶的表达进行了强化,结果表明,单一表达基因serAT410STOP、thrA以及两者共表达时,麦角硫因发酵浓度分别提高至(134.83±4.22) mg/L、(130.26±3.34) mg/L以及(144.97±5.40) mg/L.最后,采用分批补料发酵策略,菌株E 1-A 1-thrA-serA*在无机盐培养基和丰富培养基培养中的产量分别为548.75 mg/L和710.53 mg/L.

关键词：

麦角硫因代谢工程大肠杆菌氨基酸分批补料发酵

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超嗜热古菌Thermococcus eurythermalis A501编码B家族DNA聚合酶的生化特性及PCR应用

翁妍刘喜朋

807-819页

查看更多>>摘要：DNA聚合酶广泛应用于PCR技术,在生命科学研究及相关领域发挥重要作用.但目前商业化DNA聚合酶仍不能完全满足科研需要,有必要寻求高性能DNA聚合酶.文中克隆表达了超嗜热古菌(Thermococcus eurythermalis) A501来源的B家族DNA聚合酶基因(NCBI数据库基因登录号为TEU_RS04875)、表征该重组蛋白的生化特性、评价了其PCR应用.将删除intein蛋白序列的DNA聚合酶(Teu-PolB)进行体外重组表达,经亲和层析和离子交换层析纯化获得Teu-PolB蛋白;利用5'端带荧光标记的寡核苷酸作为底物,用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定Teu-PolB的生化特性;以噬菌体λDNA基因组为模板,探究Teu-PolB的PCR应用.结果显示,Teu-PolB具有DNA聚合酶活性和3'→5'核酸外切酶活性,该酶在98℃下的半衰期约为2h,热稳定性高.使用Teu-PolB进行PCR扩增,最适PCR缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,2.5 mmol/L MgC12,60 mmol/L KC1,10 mmol/L (NH4)2SO4,0.015％ Triton X-100和0.01％ BSA,最适延伸温度为68℃.此外,Teu-PolB能在2kb/min条件下成功扩增4kb目的片段,扩增产量弱于商品化Taq DNA聚合酶,优于Pfu DNA聚合酶,但扩增速率和保真度优于Taq和Pfu DNA聚合酶,且对盐的耐受性较高.综上所述,本研究鉴定了一种高保真DNA聚合酶Teu-PolB的生化特性,结果表明该酶可应用于PCR扩增,具有热稳定性高、耐盐性能好、扩增速率高、保真度高等特征.

关键词：

超嗜热古菌DNA聚合酶PolBPCR

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基于基因互作网络熵量化细胞分化状态

关天昊高洁

820-830页

查看更多>>摘要：细胞动态过程的研究表明,细胞在动态过程中会发生状态变化,主要由细胞内部的基因表达情况控制.随着高通量测序技术的发展,大量的基因表达数据能够在单细胞水平上获得细胞真实的基因表达信息.然而,现有大多数研究方法需要使用除基因表达以外其他的信息,带来了额外的复杂度和不确定性.此外,普遍存在的"缺失值"事件更是影响了对细胞动态发展的研究.为此,文中提出了基因互作网络熵方法,来量化细胞的分化状态,以此来研究细胞的发展动态.具体而言,通过借助网络的稳定性,依据基因间的关联来构造细胞特异性网络,并定义基因互作网络熵,从而将不稳定的基因表达数据转换成相对稳定的基因互作网络熵.该方法没有额外的复杂度和不确定性,同时在一定程度上规避了"缺失值"事件的影响,能更可靠地表征诸如细胞命运,等生物学过程.将该方法应用于头颈部鳞状细胞癌和慢性髓细胞白血病两个单细胞RNA-seq数据集,不仅能够有效区分恶性细胞与良性细胞、有效区分不同分化时期,还可以有效反映疾病疗效过程,证明了利用基因互作网络熵方法研究细胞动态的潜力.该方法旨在探索单细胞混乱程度水平的动态信息,从而研究生物系统进程中的动态变化情况.研究结果能够为细胞分化、追踪癌症发展以及疾病对药物反应过程等研究提供科学建议.

关键词：

单细胞RNA-seq数据基因互作网络熵细胞动态过程分化状态

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