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生物技术通报
生物技术通报

路铁刚

月刊

1002-5464

biotech@caas.cn

010-82109925，82109903

100081

北京海淀区中关村南大街12号

生物技术通报/Journal Biotechnology BulletinCSCD北大核心CSTPCD
查看更多>>本刊客观报道国内外生物技术领域基础研究成果及其在农、林、牧、渔及医药、食品、轻工、环保领域中的应用和产业化趋势。内容包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程、蛋白质工程以及生物工程的应用、研究现状和新的实验技术与方法等。
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    拟南芥AtiPGAM2基因参与非生物胁迫的响应

    李景艳周家婧袁媛苏晓艺...
    215-224页
    查看更多>>摘要：[目的]AtiPGAM2 基因是拟南芥(Arabidopsis thaliana)碱性磷酸酶超家族的成员,参与糖酵解过程.研究AtiPGAM2 基因在逆境胁迫下的响应机制,为进一步研究AtiPGAM2 的抗逆功能奠定基础.[方法]使用PlantCARE在线软件对AtiPGAM2 基因启动子顺式作用元件进行分析.采用实时荧光定量PCR,检测AtiPGAM2 在NaCl和ABA胁迫下的响应模式.克隆AtiPGAM2 基因转入拟南芥,获得AtiPGAM2 基因超表达株系.利用三引物法鉴定Atipgam2 突变体.对过表达、突变体和野生型在盐胁迫下的萌发率、绿苗率以及各种非生物胁迫(甘露醇、ABA和MeJA)下的表型,进行统计分析.[结果]其启动子上存在多个光、MeJA、低温、ABA、SA、GAs等非生物胁迫和激素响应元件.荧光定量PCR分析显示,AtiPGAM2 在NaCl和ABA胁迫下受到不同程度的诱导.成功获得AtiPGAM2 基因过表达和突变体株系.在盐胁迫条件下AtiPGAM2 过表达株系萌发率以及绿苗率均高于野生型,突变体表型则相反.甘露醇处理下突变体的萌发率低于野生型.ABA处理 48 h内突变体和过表达AtiPGAM2 株系的萌发率都低于野生型.MeJA处理下过表达的侧根数量高于野生型,突变体则相反.[结论]AtiPGAM2具有耐盐性,该基因响应甘露醇、ABA和MeJA处理.

    AtiPGAM2拟南芥盐胁迫非生物胁迫甘露醇ABAMeJA

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    不同多年生稻品种内生细菌群落多样性比较分析

    孔德婷齐笑含刘兴蕾李丽萍...
    225-236页
    查看更多>>摘要：[目的]为了解多年生稻内生细菌微生态的结构和潜在功能,探究多年生稻内生细菌与寄主优良性状的关系.[方法]通过 16S rRNA扩增子测序技术比较分析了不同多年生稻品种(PR23、PR25 和PR107)内生细菌多样性、物种组成和代谢功能.[结果]不同基因型的多年生稻具有不同的内生细菌群落,三者β多样性存在显著差异.多年生稻地下和地上部组织分化形成了不同的内生细菌群落,其地下部内生细菌主要由变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)等组成,而地上部内生细菌主要由变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)等组成.不同多年生稻内生细菌特有扩增子序列变体(amplicon sequence variants,ASVs)数量较多,且具有不同的优势内生细菌属和生物标记物种类.多年生稻内生细菌的代谢功能主要为生物合成、生物降解与利用、解毒、代谢产物前体和能量的产生、甘氨酸途径、大分子修饰和代谢簇.品种间内生细菌的差异代谢功能主要涉及酯类、醇类、糖类等物质的生物合成和降解.[结论]寄主基因型和组织分化影响了多年生稻内生细菌的群落结构、物种组成和代谢功能.

    多年生稻内生细菌群落结构16SrRNA测序

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    景迈山古茶园与现代有机茶园根际土壤微生物群落研究

    於莉军王桥美彭文书严亮...
    237-247页
    查看更多>>摘要：[目的]研究不同生境茶园茶树根际土壤微生物群落的组成及多样性,识别影响茶树根际土壤微生物的主要驱动因素,为根际土壤微生物群落和茶树病虫害防治之间的关系研究以及土壤微生物的功能和开发利用提供理论依据.[方法]采用 Illumina-MiSeq 高通量测序技术对古茶园与现代有机茶园根际土壤微生物的群落组成和多样性进行探究,采用冗余分析对土壤养分与微生物之间关系进行探索.[结果]现代有机茶园根际土壤中阳离子交换量、有机质、腐殖质、氨氮、铵态氮、有效磷和水分高于古茶园,具有显著差异;不同茶园的优势细菌种群均为放线菌门、酸杆菌门和浮霉菌门,真菌种群均为子囊菌门、被孢霉门和担子菌门,除未明确分类地位的属以外,古茶园与现代有机茶园的优势菌属组成非常相似,但是每个菌属在不同茶园中的相对丰度都存在较大差异.冗余分析表明,阳离子交换量、有机质、腐殖质、氨氮和铵态氮是造成茶园根际土壤微生物群落结构与多样性差异的主要环境因子.[结论]现代有机茶园根际土壤养分与物种丰富度显著高于古茶园,不同茶园根际土壤中的优势菌属组成高度相似,但其丰度差异显著,与土壤养分呈现高度相关性.

    景迈山普洱茶古茶园根际微生物高通量测序群落结构

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    萎缩芽孢杆菌CNY01的生防特性及其对玉米的抗盐促生作用

    孙亚楠王春雪王欣杜秉海...
    248-260页
    查看更多>>摘要：[目的]从黄河三角洲盐碱地中筛选到具有抗盐促生作用的一株根际菌,制成菌剂用于缓解玉米植株的高盐胁迫.[方法]通过功能培养基、16S rDNA序列和全基因组分析,确定菌株种属以及对玉米植株的抗盐促生效果.[结果]从黄河三角洲盐碱地中筛选到一株可在0-16%的NaCl和pH 5-8的条件下正常生长的萎缩芽孢杆菌CNY01,该菌株可促进玉米在高盐条件下生长,具有降蛋白和解钾的能力,还可抑制青枯雷尔氏菌、串珠镰刀菌等病原菌的生长.玉米植株在含 100 mmol/L NaCl的营养液中生长8 d时,施加菌株CNY01 可使植株的生理株高、根长和鲜重分别提高 38.80%(P<0.01)、23.73%和 28.19%(P<0.01).玉米植株在加 100 mmol/L NaCl的高盐盆栽条件下生长 28 d时,菌株CNY01 可使植株的株高、地上鲜重和地下鲜重分别提高 10.84%、41.87%(P<0.01)和 23.29%.全基因组序列分析也预测出该菌株基因组中含有维持细胞渗透压、合成应激蛋白等缓解高盐胁迫的基因.[结论]从黄河三角洲盐碱地中筛选到一株具有防病促生功能的萎缩芽孢杆菌CNY01,对玉米植株有显著的抗盐促生作用,结合基因组结果预测到该菌株含有与抗盐促生相关基因,是重要的菌种资源.

    玉米植物根际促生细菌萎缩芽孢杆菌抗盐促生全基因组测序

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    少孢节丛孢菌几丁质酶AO-492对线虫的降解作用研究

    张嘉华张慧梅马喜喜孙焱森...
    261-268页
    查看更多>>摘要：[目的]为探究捕食线虫真菌少孢节丛孢菌几丁质诱导过程中分泌蛋白AO-492 的生物学功能.[方法]对少孢节丛孢菌几丁质酶AO-492 主要结构域编码区进行基因克隆及分子特征分析,并在毕赤酵母中进行表达.利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白ReAO-Z492,采用NAG检测法分析了该重组蛋白在不同温度、pH及金属离子条件下的酶学活性,并将其作用于秀丽隐杆线虫及虫卵分析其生物学功能.[结果]几丁质酶AO-492 有信号肽,无跨膜结构域,含有两个几丁质结合结构域和一个糖苷水解酶18 家族结构域,并含有糖苷水解酶 18 家族几丁质酶高度保守的底物结合位点-SVGGWT-和水解酶活性位点-FDGGDLDWE-,含有典型的TIM桶形分子结构.系统进化分析显示,该蛋白与坚粘孢单顶孢几丁质酶(EPS35099.1)的亲缘关系相对最近.SDS-PAGE和Western Blot分析表明,ReAO-Z492 分子量约为 59 kD,可与小鼠抗少孢节丛孢菌多克隆抗体发生特异性反应.ReAO-Z492 最适温度为 40℃,最适pH为 7.0;Mg2+对其酶活有促进作用,而Ag+、Cu2+、Fe3+和Zn2+有抑制作用.ReAO-Z492 对秀丽隐杆线虫体壁及其虫卵卵壳有较强的降解活性.[结论]少孢节丛孢菌几丁质酶 AO-492对秀丽隐杆线虫及虫卵具有较强的降解作用.

    少孢节丛孢菌几丁质酶ReAO-Z492酶学活性捕食线虫真菌

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    碳水化合物结合域对木聚糖酶酶学性质的影响

    蒋文萍冉秋萍刘家书张慧敏...
    269-279页
    查看更多>>摘要：[目的]旨在探究不同来源碳水化合物结合域(CBM)对山毛榉木聚糖的结合能力,并将具有较高结合能力的外源CBM融合到链霉菌L10904 木聚糖酶(XYN)的C端和N端,以探究外源CBM对木聚糖酶酶学性质的影响.[方法]通过底物吸附方法,利用考马斯亮蓝G250 法检测溶液中CBM在吸附前后的浓度,计算CBM的底物结合率,筛选到了结合木聚糖能力较好的CBM1 和CBM4.为了探究对底物结合能力高的CBM融合位置对木聚糖酶酶学性质的影响,将CBM1 和CBM4 通过柔性连接肽分别与XYN的C端和N端融合,并在大肠杆菌中表达获得 4 种重组酶,分别命名为CBM1-XYN、XYN-CBM1、CBM4-XYN和XYN-CBM4.[结果]CBM1 和CBM4 与木聚糖结合率分别为 89%和 95%.在 60℃,pH 7.0 反应条件下,XYN、CBM1-XYN、XYN-CBM1、CBM4-XYN和XYN-CBM4 的比活力分别是 32 274.81、49 342.21、602.48、230.42 和 2 362.24 U/mg,CBM1-XYN比活力较XYN比活力提高了 1.5 倍.酶学性质分析表明,CBM1 使XYN温度稳定性和pH稳定性得到了提高,将XYN和CBM1-XYN分别在 60℃孵育 1 h,CBM1-XYN残余酶活力和XYN残余酶活力分别为 81%和 28%;在pH 3-11 范围内,CBM1-XYN在 4℃孵育 12 h后能够保持 90%以上的酶活力.[结论]在大肠杆菌中成功异源表达了链霉菌来源的木聚糖酶,筛选到了对底物结合率高的两种CBM1 和CBM4,并通过蛋白质融合技术成功将CBM融合到XYN上,获得酶学性质得到改良的CBM1-XYN,能够提高木聚糖酶的温度稳定性、pH耐受性及比酶活.

    碳水化合物结合域木聚糖酶融合蛋白可溶性表达比活力温度稳定性pH稳定性

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    多花黄精查尔酮合酶PcCHS的原核表达、亚细胞定位及表达分析

    潘萍萍徐志浩张怡雯李青...
    280-289页
    查看更多>>摘要：[目的]探究查尔酮合酶(chalcone synthase,PcCHS)基因在多花黄精类黄酮合成中的作用,为后续解析PcCHS功能以及多花黄精新品种选育提供可靠的理论依据.[方法]以多花黄精为cDNA模板,克隆多花黄精PcCHS基因的编码序列,对该基因进行生物信息学分析.通过构建PcCHS的原核表达载体,纯化目的重组蛋白,验证该酶的体外表达活性.利用瞬时超表达体系探究该基因过表达后总黄酮的含量变化.利用Gateway技术构建亚细胞定位载体 35S::PcCHS-GFP,通过本氏烟草表达系统确定目的蛋白亚细胞定位情况.[结果]PcCHS基因的开放阅读框为 1 251 bp,理论分子量为 44.63 kD,等电点为 5.89,属于亲水蛋白,与石刁柏(Asparagus officinalis)CHS亲缘关系较近.原核表达实验表明,pET28a-PcCHS经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达可溶性重组蛋白,Western-blot显示大小约为 45 kD,与预期大小一致,且纯化的目的蛋白具有一定的酶活性,能催化对香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A转化为柚皮素查尔酮.此外,PcCHS瞬时超表达中,PcCHS组的表达量显著高于空载K组,总黄酮含量也显著高于空载K组,最高可达 1.83 倍.亚细胞定位结果显示,该基因在细胞膜和细胞核中发挥作用.[结论]PcCHS基因原核表达的酶具有体外酶活性,其亚细胞定位于细胞膜和细胞核,且瞬时超表达能够显著提高多花黄精叶片总黄酮含量.

    多花黄精查尔酮合酶基因(CHS)原核表达瞬时超表达蛋白纯化体外酶活亚细胞定位

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    厌氧表达乳酸脱氢酶以提高大肠杆菌产D-乳酸光学纯度

    王周余杰王金华王永泽...
    290-299页
    查看更多>>摘要：[目的]为解决在D-乳酸工业发酵生产中使用农业粗加工或废弃物等廉价原料(含有少量L-乳酸)而导致终产物D-乳酸光纯降低的问题.[方法]构建了带有不同启动子的L-乳酸脱氢酶基因lldD的表达质粒:pUC19-PLD(PpflBp6)、pUC19-NLD(PnirB)及pUC19-PNLD(PpflBp6-PnirB),并将它们分别转化入大肠杆菌D-乳酸工程菌HBUT-D中,得到菌株HBUT-D3、HBUT-D5 和HBUT-D7.通过LldD的酶活检测以及对NBS培养基(添加 1 g/L L-乳酸)发酵结果的TOPSIS多元评估,优选出可快速去除L-乳酸且不影响D-乳酸发酵的菌株,并使用农业廉价原料进行发酵.[结果]HBUT-D7 的LldD比酶活为64 U/g,L-乳酸的消耗速率为 34 mg/(L·h),D-乳酸的生产强度为 4.09 g/(L·h),综合评估为最优菌株.以玉米浆为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7 的L-乳酸消耗速率分别为 10.41 mg/(L·h)及 34.75 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为 4.24 g/(L·h)及 3.87 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为 99.07%及 99.92%.以糖蜜为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7 的L-乳酸消耗速率为6.87 mg/(L·h)和 17.18 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为 1.93 g/(L·h)及 1.88 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为 99.22%及 99.99%.[结论]厌氧诱导启动子的表达质粒可提高菌株HBUT-D7 的L-乳酸脱氢酶酶活,使其在使用廉价原料发酵时能有效消除L-乳酸,提高发酵终产物D-乳酸的光学纯度.

    D-乳酸光学纯度大肠杆菌L-乳酸脱氢酶nirB启动子pflB启动子串联启动子

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    H5Nx禽流感病毒交叉反应性CD4+T细胞表位预测

    谢爽陈瑶黄俊琼
    300-309页
    查看更多>>摘要：[目的]评估预先存在的H5Nx交叉反应性免疫记忆,为人类H5 禽流感病毒的防治和广谱疫苗的研发提供理论数据.[方法]利用生物信息学方法筛选人源H5Nx禽流感病毒与季节性流感病毒的共同保守的交叉反应性CD4+T细胞表位,进一步分析保守表位嵌套CD8+T细胞表位和B细胞表位情况以及在中国人群中的覆盖率.[结果]92.3%(513/555)的H5Nx CD4+T细胞表位在季节性甲型流感病毒中具有交叉反应性,其中 172 个表位嵌套CD8+T细胞表位和 5 个表位嵌套B细胞表位.这些表位与相应HLA-DRB1 等位基因在全世界人群中的覆盖率为 88.65%.[结论]由于反复接触季节性甲型流感病毒,人群中存在一定水平的的H5Nx交叉反应性免疫记忆,能够为H5Nx感染提供部分保护.

    H5Nx流感病毒共同保守交叉反应性CD4+T细胞表位嵌套表位

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    幽门螺杆菌katA基因功能及其在耐受氧化损伤中的作用分析

    王鑫鑫管玉祝李晓苇洪伟...
    310-320页
    查看更多>>摘要：[目的]过氧化氢酶(KatA)是幽门螺杆菌编码的重要毒力因子,在抵抗宿主免疫杀伤和疫苗研发等方面具有重要功能.为了鉴定幽门螺杆菌 KatA 的酶学特性,并分析其在幽门螺杆菌氧化耐受中的功能.[方法]首先,从幽门螺杆菌临床耐药菌株 Hp_G272 基因组中分离 katA 基因,并在大肠杆菌中克隆表达、分离纯化KatAG272 蛋白;然后,利用 CAT 检测试剂盒体外分析KatAG272 的过氧化氢酶活性;其次,利用同源重组技术构建 katA 基因工程菌株,包括敲除菌株和回补菌株;最后,通过比较野生菌株与工程菌株生长表型差异、分解过氧化氢能力差异及耐受过氧化氢能力差异,阐述 katA 基因的功能及其在幽门螺杆菌耐受氧化损伤中的作用.[结果]在大肠杆菌中成功克隆表达并分离纯化 KatAG272,体外酶学分析表明,KatAG272 是一类嗜酸性过氧化氢酶,基因敲除分析表明,敲除该基因幽门螺杆菌丧失分解和耐受过氧化氢的能力,而回补该基因幽门螺杆菌回复分解和耐受过氧化氢的能力.[结论]katA基因是幽门螺杆菌分解和耐受过氧化氢的唯一功能基因,在幽门螺杆菌氧化耐受中具有重要功能.

    幽门螺杆菌过氧化氢酶katA耐受性克隆表达基因敲除

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