查看更多>>摘要:针对酵母生长互补方法的缺点,利用pH指示剂指示酵母胞外酸化,建立一种检测候选SWEET(sugars will eventually be exported transporter)基因转运活性的新方法.使用 0.006%溴甲酚紫(BCP)作为pH指示剂,获得不同pH值下波长589 nm和432 nm的光吸收值A589和A432,建立pH值与A589/A432比值(R589/432)的相关性函数方程.从火龙果(Hylocereus polyrhizus)果实中分离HpSWEET1a和HpSWEET4a基因,两者编码蛋白序列与拟南芥AtSWEET1和AtSWEET4分别具有66.67%和55.36%的一致性,分别属于SWEET Ⅰ和Ⅱ类成员.利用酵母糖吸收缺陷株系EBY.VW4000表达HpSWEET1a和HpSWEET4a基因,糖饥饿处理后添加葡萄糖或果糖,HpSWEET1a、HpSWEET4a和AtSWEET1(At1g21460,阳性对照)均促使酵母胞外BCP颜色在3~16 h由紫色变为黄色,说明发生明显的胞外酸化.进一步的试验表明HpSWEET1a、HpSWEET4a和AtSWEET1促进酵母胞外pH值在3~16 h下降约1.00,载体对照仅下降约0.10.酵母胞外酸化和pH值的明显下降,证明了 HpSWEET1a、HpSWEET4a与AtSWEET1功能类似,均具有葡萄糖和果糖转运活性.使用基于超微量分光光度的比色法检测R589/432值,进一步简化检测步骤和缩短时间.添加葡萄糖后培养0.5 h,HpSWEET1a的R589/432值的下降水平远大于载体对照,证明该方法有效.本研究中建立的方法从耗时、准确性、操作和通量等方面均优于目前常用的酵母生长互补检测,可广泛应用于定位细胞膜的SWEET转运蛋白研究.