查看更多>>摘要:为建立急性肝胰腺坏死病(Acute Hepato Pancrentic Necrosis Disease,AHPND)实时荧光重组酶介导扩增(Recombinase Aided Amplification,RAA)快速检测方法,根据NCBI中致急性肝胰腺坏死病的副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VpAHPND)中PVA1质粒的保守序列设计了3对引物和1条探针,通过荧光值和出峰时间,筛选引物、优化反应温度、评估方法的敏感性和特异性,同时把该方法应用于临床模拟环境DNA(Environmental DNA,eDNA)样品检测.结果显示,筛选出的VpAHPND的F2/R2引物组特异性强,仅能扩增VpAHPND 阳性核酸,与常见的对虾病原肝肠胞虫(Enterocytozoon Hepato Penaei,EHP)、白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus,IHHNV)、细菌性肝胰腺坏死(Infection with Hepatobacter Penaei,NHPB)、十足目虹彩病毒1型感染(Decapod Iridescent Virus 1,DIV1)、副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus,VP)均无交叉反应;检测方法灵敏度高,检测限低至1.4×102 copies/μL,并且在20 min内快速完成了VpAHPND的检测.采用实时荧光RAA法,在64份临床模拟环境DNA(eDNA)样品中检出VpAHPND阳性8份,检测结果与荧光定量PCR检测方法一致.研究表明eDNA采样策略与VpAHPND的实时荧光RAA检测方法相结合,能大大提升临床诊断速度,可为急性肝胰腺坏死病快速检测提供重要的技术依据.