查看更多>>摘要:向日葵锈病是向日葵生产中的重要病害之一,严重影响向日葵的产量和品质.然而,向日葵锈菌的作用机理与发病机制不清晰,尚没有明确的致病关键因子,难以获得准确的防治靶标.因此,鉴定锈菌致病因子,明确其作用机理,对病害的精准控制具有重要意义.经课题组前期研究发现,向日葵锈菌胞外金属蛋白酶PhMEP1在锈菌致病过程中发挥重要作用,为揭示其致病机理,研究PhMEP1与寄主互作的位点,本文首先利用生物信息学软件对PhMEP1的信号肽序列进行分析,预测信息显示基因ORF序列区域前22个氨基酸为信号肽;然后借助酵母分泌系统信号肽筛选法通过不同的选择性介质和颜色反应来评估信号肽是否具有分泌功能.结果显示,信号肽融合蛋白的酵母转化子可以在YPRAA培养基(YPR agar medium,YPRAA)上正常生长,说明重组菌株能成功分泌蔗糖酶促使棉籽糖分解成单糖;同时将生成的单糖进行2,3,5-三苯基氯化四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)显色试验,结果显示,TTC被还原为红色的三苯甲臢(triphenylformazan,TPF).为了验证该信号肽能否在病菌与植物互作中发挥分泌功能,实验进一步利用蛋白质印迹法,检测信号肽融合蛋白在在烟草细胞中的表达情况.结果显示,在烟草质外体液(apoplastic fluid,AF)中检测到信号肽融合蛋白,说明融合蛋白在具有PhMEP1的信号肽后可向细胞间转移.以上结果均证明,金属蛋白酶PhMEP1的信号肽具有分泌活性,推测PhMEP1是由信号肽引导从胞内分泌到胞外发挥作用.