查看更多>>摘要:目的 探讨西瑞香素(DAP)抑制肾细胞癌(RCC)细胞786-O的增殖、侵袭能力和诱导铁死亡的作用及分子机制.方法 采用不同浓度DAP(0、12.5、25.0、50.0、100.0μmol/L)处理786-O细胞后,细胞计数试剂盒(CCK-8)和Transwell检测细胞增殖和侵袭能力.12.5 µmol/L DAP联合铁死亡诱导剂(0.2 μmol/L Erastin或30 nmol/L RSL3)处理细胞24 h后,CCK-8检测细胞活力.12.5 µmol/L DAP与10.0 μmol/L铁螯合剂(DFO)或50 mg/L补铁剂(FAC)联合处理细胞24 h后,用总铁和Fe2+检测试剂盒分析总铁和Fe2+水平变化.用蛋白质印迹法(Western blot)检测各蛋白的表达.两组间比较用t检验,多组间比较用单因素方差分析.结果 CCK-8结果显示,0 μmol/L DAP组吸光度值高于 12.5、25、50.100 μmol/L 组(处理 24 h:0.10±0.15 比 0.85±0.12、0.79±0.11、0.78±0.12、0.65±0.10;处理 48 h:2.23±0.28 比 1.93±0.16、1.43±0.13、1.29±0.20、0.92±0.34).Transwell 结果显示,0 µmol/L DAP 组吸光度值高于 12.5、25、50、100 μmol/L 组(2.93±0.36 比 2.24±0.40、1.90±0.44、1.18±0.29、0.97±0.37,均 P<0.05).HK-2 细胞组的GPX4 蛋白相对表达量低于 786-O 细胞组(100%比 742%,F=40.48,P<0.01).0 μmol/L DAP 组GPX4蛋白灰度值高于12.5、25、50、100 μmol/L组(每组相对灰度值分别为1、0.84、0.81、0.73、0.49).CCK-8结果显示,DAP联合Erastin组吸光度值低于DAP和Erastin单独处理组[(1.61±0.46)L/(g·cm)比(2.43±0.11)L/(g·cm)和(2.38±0.41)L/(g·cm),均 P<0.05],同时,DAP联合RSL3组吸光度值低于DAP或RSL3单独处理组[(0.62±0.53)L/(g·cm)比(1.89±0.53)L/(g·cm)或(1.52±0.26)L/(g·cm),均 P<0.05].另外,DAP 联合 Erastin 或 RSL3 组GPX4蛋白灰度值低于control、DAP、Erastin或RSL3组(每组相对灰度值分别为0.71、0.46、1、0.92、0.84、1.18).786-O细胞组FTH1蛋白表达与HK-2细胞组间的差异无统计学意义(141.33%比100.00%,F=1.49,P>0.05).但是,0 μmol/L DAP 组 FTH1 蛋白灰度值高于 12.5、25、50、100 μmol/L组(每组相对灰度值分别为l、0.95、0.82、0.62、0.47).Fe2+水平检测结果显示,DFO组的 Fe2+水平低于 control 组和 DAP 组[(0.21±0.03)nmol/106 比(0.56±0.14)nmol/106 和(1.22±0.26)nmol/106,均 P<0.05];而 DAP+DFO 组的 Fe2+水平高于 DFO 组[(0.62±0.15)nmol/106 比(0.21±0.03)nmol/106,P<0.05].另外,0 μmol/L DAP组FoxO3a蛋白相对表达量低于其他浓度组(1.00 比 1.45±0.32,P>0.05;1.00 比 1.65±0.40、1.55±0.32、1.55±0.13,均 P<0.05);0 µmol/L DAP组pGSK-3β(Ser9)蛋白相对表达量高于其他浓度组(1.00比1.02±0.15,P>0.05;1.00 比 0.82±0.04、0.72±0.03、0.67±0.11,均 P<0.05),GSK-3β、TIGAR、KIF18A、PSMA/FOLHI/NAALADaseI蛋白在各组间表达差异无统计学意义(P>0.05).786-O细胞组GSK-3β和pGSK-3β 蛋白相对表达量低于 HK-2 细胞组[(58.00±3.00)%比 100%,F=588.00,P<0.01;(43.67±1.53)%比 100%,F=4 080.14,P<0.01],而 FoxO3a 蛋白相对表达量高于 HK-2 细胞组[(164.67±23.54)%比 100%,F=22.63,P<0.01].上调 pGSK-3β 组的 GPX4 和 FTH1 的蛋白表达与vector组比较差异无统计学意义(P>0.05).下调FoxO3a组的GPX4和FTH1蛋白相对表达量低于 shNC 组[GPX4:100%比(69.33±10.07)%、(48.00±10.82)%、(54.67±26.58)%和(29.33±6.43)%,F=10.87,均P<0.05;FTH1:100%比(90.33±33.25)%,P>0.05,100%比(64.67±16.26)%、(55.00±12.53)%和(48.00±13.23)%,F=4.49,均 P<0.05].DAP 组pGSK-3β蛋白灰度值低于shNC组,pcDNA3.1-GSK-3β组pGSK-3β蛋白灰度值高于shNC组和DAP组,pcDNA3.1-GSK-3β+DAP组pGSK-3β蛋白灰度值却未高于DAP组(GSK-3β相对灰度值分别为1.00、1.21、1.25、1.53;pGSK-3β 相对灰度值分别为 1.00、0.79、1.34、0.57).DAP 组 FoxO3a 蛋白灰度值高于shNC组,shFoxO3a-811和shFoxO3a-1 156组FoxO3a蛋白灰度值低于shNC组和DAP组,但是,联合组的FoxO3a蛋白灰度值却未低于DAP组(各组相对灰度值分别为1.00、1.36、0.52、1.33、0.81、1.27).结论 DAP通过抑制GPX4和FTH1蛋白表达、增加Fe2+水平诱导786-O细胞铁死亡进而抑制增殖和侵袭,但DAP并不直接调控pGSK-3β/FoxO3a途径.