查看更多>>摘要:目的 探讨去乙酰化酶3(sirtuins3,SIRT3)在中波紫外线(ultraviolet B,UVB)诱导的人视网膜色素上皮细胞凋亡中的影响及作用机制.方法 将人视网膜色素上皮-19(adult retinal pigment epithelial cell line-19,ARPE-19)细胞分别在0(对照)、10、20、30、40、50、60 mJ/cm2 强度 UVB 下照射 12 h、24 h,采用 4-甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法测定细胞活性,采用蛋白免疫印迹法和实时荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)法分别测定SIRT3蛋白和mRNA的表达水平.将ARPE-19细胞在无血清OPTI-MEM中与空载体+siRNA对照序列(阴性+UVB组)、SIRT3特异性pBABE-Puro 载体(SIRT3+UVB 组)或 SIRT3 特异性小干扰 RNA 序列(20 nmol/L siSIRT3+UVB 组)孵育,同时加入 Lipofectamine RNAiMAX转染试剂,培养24 h后,将阴性+UVB组、siSIRT3+UVB组、SIRT3+UVB组细胞用50 mJ/cm2 UVB照射12 h后,继续培养24 h;未经转染处理,但同样经UVB照射的细胞作为UVB组,而未经转染和UVB照射处理的细胞作为空白组.测定细胞中SIRT3蛋白和mRNA的表达水平,采用流式细胞术检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平和细胞凋亡;采用CaTM-2/AM探针和Rhod-2/AM探针检测细胞内和线粒体内钙离子(calcium ion,Ca2+)浓度.采用RNA测序和基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)确定受SIRT3影响的途径.结果 与对照组相比,不同照射强度UVB下ARPE-19细胞处理12 h和24 h后,细胞存活率均下降,差异有统计学意义(P<0.05);且随着UVB照射强度的升高,ARPE-19细胞的存活率呈下降趋势.与对照组相比,不同照射强度UVB下ARPE-19细胞处理12 h后,细胞SIRT3 mRNA和蛋白表达水平均下降,除10 mJ/cm2 UVB组SIRT3蛋白外,差异均有统计学意义(P<0.05);且随着UVB照射强度的升高,ARPE-19细胞SIRT3 mRNA和蛋白表达水平均呈下降趋势.与空白组相比,UVB组ARPE-19细胞凋亡率和ROS生成量均增加,差异有统计学意义(P<0.05);然而阴性+UVB组细胞凋亡率和ROS生成量与UVB组相比,差异均无统计学意义(P>0.05).与阴性+UVB组相比,siSIRT3+UVB组细胞凋亡率和内源性ROS生成量均升高,而SIRT3+UVB组细胞凋亡率和内源性ROS生成量均降低,差异均有统计学意义(P<0.05).与空白组相比,UVB组ARPE-19细胞浆和线粒体内钙离子浓度均增加,差异有统计学意义(P<0.05);然而阴性+UVB组细胞浆和线粒体内钙离子浓度与UVB组相比,差异均无统计学意义(P>0.05).与阴性+UVB组相比,siSIRT3+UVB组细胞浆和线粒体内钙离子浓度均升高,而SIRT3+UVB组细胞浆和线粒体内钙离子浓度均降低,差异均有统计学意义(P<0.05).GESA结果显示,与AMD视网膜形态维持和JAK-STAT级联通路相关的基因在过表达SIRT3的ARPE-19细胞中富集.结论 UVB可诱导ARPE-19细胞SIRT3表达下调;而SIRT3过表达后可通过抗氧化作用和维持细胞内Ca2+稳态来保护ARPE-19细胞免受UVB照射诱导的损伤.