查看更多>>摘要:[目的]目前国内流行的变异非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)表现出毒力低,传染性强,隐蔽性强的特点,非洲猪瘟(African swine fever,ASF)临床表现不明显,早期诊断难度大,快速灵敏的早期诊断试剂盒对于非洲猪瘟防控至关重要,而p30的研究及其多克隆抗体的制备可以为早期诊断试剂盒的开发提供重要的理论依据.[方法]根据中国农业科学院哈尔滨兽医研究所分离的非洲猪瘟毒株 Pig/Heilongjiang/HRB1/2020(GenBank:MW656282)提供的 p30 的氨基酸序列,利用生物信息学软件对该序列的理化性质,亲/疏水性,跨膜区,信号肽及二三级结构进行分析预测,由生物公司优化密码子并合成重组质粒pET-28a-p30.将p30克隆到pET-32a(+)原核表达载体中,将其转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,对异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导浓度、诱导温度及诱导时间进行优化,用纯化所得的p30蛋白对小鼠进行3次免疫,获取多克隆抗体并检测效价.[结果]由生物信息学分析结果得出p30 蛋白含 194 个氨基酸,分子式为C1001H1575N259O308S7,p30 蛋白为亲水性蛋白,不含跨膜区,无信号肽,二三级结构中含大量的α-螺旋.蛋白表达结果显示,当诱导时间为6 h,IPTG终浓度为0.05 mmol/L,诱导温度为34℃时,p30重组蛋白表达量达到最佳,浓度高达0.9 mg/mL以上,1 L菌液可产53 mg重组蛋白.通过间接ELISA测得小鼠血清抗体效价高达1:10 000 000.Western Blotting结果显示,制备的p30蛋白具有较好的特异性.[结论]经过表达优化p30蛋白产量得到明显提高,并获得效价较高的多克隆抗体,且具有很好的特异性.对研发针对p30更加灵敏的诊断试剂盒提供了重要的理论依据.