查看更多>>摘要:[目的]分析鉴定油茶sRNA的种类、数量和特征,揭示mi RNA及靶基因的功能,为利用miRNA及靶基因进行油茶遗传改良提供理论依据.[方法]以优良油茶品种'横冲 89'为材料,采集嫩叶和成熟种子,提取总RNA,磁珠分离富集mRNA,利用Illumina RNA-seq高通量测序技术构建sRNA文库,分析sRNA的结构特征、种类和数量、公共序列及特有序列.将sRNA定位到油茶转录组上,分析比对上的总sRNA种类和数量,进行已知miRNA比对分析和首位碱基偏好性分析.利用miREvo和mirdeep2软件分析新miRNA的前体和成熟体,预测新miRNA,进行miRNA家族分析;进行miRNA表达与差异分析、层次聚类分析.最后,进行miRNA靶基因预测、候选靶基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析以及参与光合作用、油酯代谢miRNAs的表达分析和靶基因筛选.[结果]分别构建了油茶叶和种子的sRNA文库,18~40个核苷酸(nucleotide,nt)的净读长分别为14 256 189条和10 822 313条,属于6 138 179和4 980 518种sRNA.其中,24-nt sRNA最多.叶和种子sRNA的公共序列为773 647种,特有序列分别为4 206 871种和5 364 532种.在两个sRNA文库中,比对上油茶转录组参照序列的总读长分别为5 855 009和4 122 070条,比对上的miRNA前体为118种,miRNA成熟体为78个.研究发现:18~23 nt已知miRNA首位碱基多偏好U.鉴定出54个新miRNA,22个已知miRNA家族,包括105个已知家族成员;67个表达差异miRNA,调控1346个靶基因.其中,26个miRNAs为显著差异表达,调控644个靶基因.聚类分析表明:显著差异表达的miRNA被分为2族,一族在叶和种子中表达较低,另一族则表达较高.GO分析揭示差异表达miRNA的候选靶基因在生物学过程、细胞组分、分子功能3大类的51个条目中富集.KEGG分析表明:差异表达miRNA的候选靶基因在萜类主链生物合成、甘油酯代谢、氨酰tRNA生物合成等代谢过程中显著富集.此外,研究发现:ath-miR5658和gma-miR169v在叶和种子中差异表达,确定它们分别对应碳固定、光合作用途径中的类NADP依赖型苹果酶、果糖二磷酸醛缩酶1、光系统I反应中心亚基Ⅳ B,以及甘油脂代谢中的单半乳糖酰二酰基甘油合酶2等靶基因.[结论]初步证实了"一个miRNA调控多个靶基因,以及多个miRNA调控一个靶基因的现象";发现了ath-miR5658可能调控碳固定代谢、光合作用、甘油磷酯代谢、甘油酯代谢、脂肪酸延长等途径中靶基因的表达,gma-miR169v可能调控甘油磷酯代谢中靶基因的表达.本结论对于揭示油茶光合碳固定、脂肪酸油脂合成的调控机理,培育优质高产油茶新品种具有一定的理论价值.