查看更多>>摘要：目的 研究高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)介导的肺动脉平滑肌细胞焦亡对慢性阻塞性肺疾病相关性肺动脉高压(chronic obstructive pulmonary disease-associated pulmonary hypertension,COPD-PH)形成的影响,及复方葶苈子汤的干预机制.方法 以CCK-8法检测大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)的活性,筛选出合适的香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)干预浓度及时间用于建立细胞损伤模型.将对数生长期细胞分为对照组、CSE组、LPS组和CSE+LPS组,对照组加入细胞培养液培养细胞.CSE组加入含10％CSE的细胞培养液,LPS组加入含1 μg/mL LPS的细胞培养液,CSE+LPS组加入含10％CSE和1 μg/mL LPS的细胞培养液,培养细胞24 h后,采用CCK-8法检测细胞活性,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)检测细胞中mRNA表达,蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测细胞中蛋白表达,酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞上清液中炎症因子含量,流式细胞术检测细胞焦亡,透射电子显微镜观察细胞的超微结构.以CCK-8法检测PASMCs的活性,筛选出复方葶苈子汤含药血清和甘草酸的最佳干预浓度及时间.将对数生长期细胞分为正常组、模型组、含药血清组和抑制剂组,对照组加入细胞培养液培养细胞,模型组、含药血清组和抑制剂组加入含10％CSE和1 µg/mL LPS的细胞培养液,培养细胞24 h后弃去原培养液.正常组和模型组孔中加入含10％空白血清的细胞培养液,含药血清组孔中加入含10％复方葶苈子汤含药血清的细胞培养液,抑制剂组孔中加入含150 µg/mL甘草酸和10％空白血清的细胞培养液,再培养细胞24 h后,采用CCK-8法检测细胞活性,RT-PCR检测细胞中mRNA表达,WB检测细胞中蛋白表达,ELISA检测细胞上清液中炎症因子含量,流式细胞术检测细胞焦亡,透射电子显微镜观察细胞的超微结构.结果 筛选出10％CSE和1 µg/mLLPS用于建立细胞损伤模型,干预时间为24 h.CSE、LPS和CSE联合LPS可以使PASMCs活性下降;可以促进PASMCs 中 HMGB1、RAGE、Caspase-8和GSDMD mRNA表达,HMGB1、RAGE、pro Caspase-8、cleaved Caspase-8 和 GSDMD 蛋白表达,促进 PASMCs 上清液中白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)分泌,促进PASMCs焦亡发生.筛选出10％复方葶苈子汤含药血清和150 μg/mL甘草酸用于细胞干预,干预时间为24 h.复方葶苈子汤含药血清可以使损伤PASMCs活性升高;可以抑制损伤 PASMCs 中 HMGB1、RAGE、Caspase-8和 GSDMD mRNA表达,HMGB1、RAGE、pro Caspase-8、cleaved Caspase-8和GSDMD蛋白表达,抑制损伤PASMCs上清液中IL-1β和IL-18分泌,抑制PASMCs焦亡发生.结论 复方葶苈子汤可以通过抑制HMGB1表达,抑制Caspase-8介导的PASMCs焦亡,并抑制炎症级联反应,从而改善COPD-PH.
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